双酶水解鱼鳞蛋白制备ACE抑制肽的工艺优化研究

苑园园 刘 畅 王燚欣 宋晓鑫

（衡水学院生命科学学院 河北 衡水 053000）

现代医学研究表明，血管紧张素转化酶(An-giotensin I-converting enzyme，ACE)是导致高血压的主要因素之一[1]。ACE是人体组织和体液中发现的一种含锌的二肽羧基肽酶，能够对血压起到一定的调控作用，血管紧张素Ⅰ可以在人体内经过ACE的催化作用转化为可以使血管收缩并使血压升高的血管紧张素Ⅱ[2]。

我国水资源丰富，在鱼类产品生产加工过程中产生了很多下脚料，其中15%左右都是鱼鳞[3]，据不完全统计，我国每年废弃的鱼鳞达30万t，鱼鳞中蛋白质的含量高达50%~70%[4，5]，是非常好的生物资源。

目前制备ACE抑制肽多为单一蛋白酶水解，很少模拟胃肠道系统的酶解过程，而经其他酶水解得到的ACE抑制肽在人体消化吸收过程中，由于胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用，其氨基酸序列有可能会发生变化，进而导致ACE抑制能力的变化[6]。因此本试验选取的双酶模拟胃肠道消化系统对鱼鳞的酶解作用，可能将制备出更高活性的ACE抑制肽[7]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料。新鲜猪肺：衡水市万德福超市；新鲜鲤鱼鱼鳞：衡水市桃城区人民桥水产开发市场。

1.1.2 主要试剂。盐酸(36.0%~38.0%)：烟台远东精细化工有限公司；四硼酸钠：天津市河东区红岩试剂厂；乙酸乙酯(AR)：天津市大茂化学试剂厂；硼酸(AR)：天津市红岩化学试剂厂；胰蛋白酶：河南万邦实业有限公司；胃蛋白酶：河南万邦实业有限公司；马尿酰组氨酰亮氨酸：上海麦克林生化科技有限公司；甘氨酸：天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备。ST3100型pH计：奥豪斯仪器(常州)有限公司；BGZ-30型电热鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；Alpha 1-4/2-4 LD Plus德国Christ真空冷冻干燥机：北京五洲东方科技发展有限公司广州分公司；A11型研磨机：艾卡(广州)仪器设备有限公司；UV-5500型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；TGL-16M型离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ACE粗酶的制备。新鲜的猪肺冷藏10 h左右，将黏膜、脂肪和气管切除，将切好的猪肺放入高速组织捣碎机中，之后间歇性匀浆5min，保证比例，每5g的猪肺加入6 ml的硼酸缓冲溶液(pH值8.3，0.1 mol/L)，4℃，8 000 r/min离心15 min，收集上清液冷冻干燥备用[8]。

1.3.2 脱钙鱼鳞粉的制备。收集新鲜的鲤鱼鱼鳞，用清水洗净，去除非鱼鳞物质，洗净后50℃烘干2 h；将烘干后的鱼鳞用10%(w/v)NaCl溶液5℃浸泡24 h，换液1次[9]，50℃烘干2 h；干燥后的鱼鳞用0.4 mol/L的HCl溶液以料液比为1∶15(w/v)浸泡90 min进行脱钙[10]，用清水洗净后再次放入烘箱50℃烘干2 h，放入研磨机打碎得到鱼鳞粉冷藏备用。

1.3.3 鱼鳞酶解物的制备。取适量脱钙鱼鳞粉溶于酶的缓冲液中，调节整体的pH值在酶的最适范围内，加酶进行酶解，当酶解反应完成后应立即沸水浴15 min，保证酶彻底失活，待整个反应体系冷却后离心15 min(10℃，4 000 r/min)，取上清液[11]。

1.3.4 ACE抑制率测定。本次试验采用紫外分光光度法[12]测定ACE抑制率，取酶解物上清液作为ACE抑制肽，将马尿酰组氨酰亮氨酸(hippuryl-histidyl-leucine，HHL)溶于0.1 mol/L(pH值8.3，含Na-Cl)的硼酸盐缓冲液配成浓度为12.5 mmol/L的底物，先取50μL底物于1.5 ml离心管中，再加入20μLACE抑制肽，两者混匀后放入水浴锅37℃保持5 min，接着再取40μLACE溶液于离心管中，放入水浴锅37℃保持30 min，最后加入200μLHCl(1 mol/L)终止整个反应，离心管中加入1 ml预冷过的乙酸乙酯，混合后放入离心机4 000 r/min离心15 min，吸取上层澄清液体750νL到试管中，烘箱内120℃烘干15 min，使溶剂全部挥发，冷却后向试管中加入3 ml的蒸馏水以溶解试管中的马尿酸，混匀1 min后用紫外可见分光光度计在波长为228 nm下测定溶液的吸光值，计算公式：ACE抑制率(%)=×100%；式中：A为加入ACE抑制剂的吸光度；B为ACE与HHL反应的吸光度；C为空白反应的吸光度。

1.4 胃蛋白酶提取条件的单因素试验及正交试验优化1.4.1单因素试验。称取5份脱钙后的鱼鳞粉，料液比分别为1∶10(g/ml)、1∶15(g/ml)、1∶20(g/ml)、1∶25(g/ml)、1∶30(g/ml)，利用胃蛋白酶缓冲液调节pH值为2.0，温度控制在37℃，分别调节胃蛋白酶的添加量在2%、4%、6%、8%、10%的条件下，酶解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，以ACE抑制率为评价指标，考察酶解时料液比、胃蛋白酶的添加量、酶解时间对鱼鳞ACE抑制率的影响。

1.4.2 正交试验优化。根据单因素试验结果，设计L9(34)的正交试验，见表1。

表1 胃蛋白酶酶解脱钙鱼鳞粉正交试验因素水平表

1.4.3 胰蛋白酶提取条件的单因素试验优化。利用胰蛋白酶缓冲液将胃蛋白酶酶解液pH值调节为8.0，温度控制在40℃，分别调节胰蛋白酶的添加量在2%、4%、6%、8%、10%的条件下，酶解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，以ACE抑制率为评价指标，考察酶解时料液比、胰蛋白酶的添加量、酶解时间对鱼鳞ACE抑制率的影响。

2 结果与分析

2.1 胃蛋白酶酶解的单因素试验结果分析

2.1.1 酶的添加量对酶解产物ACE抑制率的影响。如图1，当胃蛋白酶添加量增高，ACE抑制率升高，酶的添加量达到6%时，ACE抑制率最高，酶的添加量继续增加，抑制率反而降低。当酶过少时，酶与底物结合的几率很小，抑制率较低，加酶量到达一定程度时，酶与反应体系中的底物全部结合，抑制率达到最大值，但加酶量过多时就会影响底物与之结合，从而导致抑制率降低。因此，酶的添加量为6%时，鱼鳞蛋白的酶解产物ACE抑制率最高，为57.6%。

图1 不同胃蛋白酶的添加量下酶解产物的抑制率

2.1.2 料液比对酶解产物ACE抑制率的影响。如图2，料液比增大的同时ACE抑制率也增大，当增加到1∶40时达到最大，随后抑制率降低。当料液比高时，酶解体系比较浓稠，ACE抑制率降低[13]。因此，当料液比为1∶40时，鱼鳞蛋白的酶解产物ACE抑制率最高，为67.18%。

图2 不同料液比下酶解产物的抑制率

2.1.3 酶解时间对酶解产物ACE抑制率的影响。如图3，酶解开始时，ACE抑制肽逐渐释放其活性，ACE抑制率随酶解时间的增加而升高，酶解时间为2 h时ACE抑制率最高，时间持续过长则会适得其反，ACE抑制肽会被酶解丧失活性，ACE抑制率降低[14，15]。因此，当水解时间为2 h时，鱼鳞蛋白的酶解产物ACE抑制率最高，为79.7%。

图3 不同酶解时间下酶解产物的抑制率

2.2 胃蛋白酶酶解鱼鳞蛋白正交实验优化。由表2可知，料液比、酶的添加量、酶解时间这3个因素对ACE抑制率都会产生影响，在9个试验结果中，以试验2、试验8、试验9的结果最好，ACE抑制率基本达到70%以上，最佳方案为A1B3C2，即料液比1∶50，酶的添加量4%，酶解时间2 h，该组合并未出现在正交表中，所以进行验证试验，在此条件下，经3次平行试验后测得ACE抑制率为84.89%。通过比较R值可以看出，酶解时间对ACE抑制率的影响最显著。由表3的F值大小可看出，这3个因素的影响主次顺序为：C＞B＞A。

表2 胃蛋白酶酶解脱钙鱼鳞粉正交试验结果数据

表3 胃蛋白酶酶解脱钙鱼鳞粉正交试验结果方差分析

2.3 胰蛋白酶酶解的单因素试验结果分析

2.3.1 酶的添加量对酶解产物ACE抑制率的影响。如图4，酶的添加量较少时，酶与底物结合机会较少，形成的产物较少；ACE抑制率随着加酶量的增加而升高，酶的添加量增加到一定程度而底物不变时，酶可以与底物完全结合，酶的添加量达到6%时，ACE抑制率最大；再增加胰蛋白酶的添加量时，可能会因为反应体系已饱和而降低酶与底物的结合率导致ACE抑制率逐渐降低。因此，当酶的添加量为6%时，鱼鳞蛋白的酶解产物ACE抑制率最高，为92.13%。

图4 不同酶的添加量下酶解产物的抑制率

2.3.2 酶解时间对酶解产物ACE抑制率的影响。如图5，当酶解时间过长时，产生的活性产物可能会被酶解，导致抑制率下降。当酶解时间为2 h时鱼鳞蛋白的酶解产物ACE抑制率最高，为93.37%。

图5 不同酶解时间下酶解产物的抑制率

3 结论与讨论

以脱钙后的鲤鱼鱼鳞蛋白为原料，通过单因素试验及正交试验证明，以胃蛋白酶酶解脱钙鱼鳞粉制备ACE抑制肽，当酶的添加量8%、料液比1∶50(g/ml)、酶解时间2 h时，ACE抑制率为84.89%。以胰蛋白酶酶解脱钙鱼鳞粉制备ACE抑制肽，当酶的添加量为6%、酶解时间为2 h时，ACE的抑制率为93.37%。结果表明先用胃蛋白酶酶解，再用胰蛋白酶进行酶解，最终得到的ACE抑制肽不会受人体胃肠道的影响。