补骨脂提取物对黄瓜炭疽病菌的抑制活性

关丽杰　董瑞芳

摘要：采用菌丝生长速率法、孢子萌发法，研究了补骨脂提取物及0.2%异补骨脂查尔酮可溶液剂对黄瓜炭疽病菌的抑制活性的影响。结果发现，补骨脂提取物对黄瓜炭疽病菌菌丝生长、孢子萌发均有很强的抑制作用，其中对菌丝生长的抑制中浓度EC₅₀为62.973 mg/L，孢子萌发的抑制中浓度EC₅₀为8.213 mg/L。此外，0.2%异补骨脂查尔酮可溶液剂对黄瓜炭疽病有很强的防效，当施药浓度为375倍液时，防效即达到90.90%。以上结果表明，0.2%异补骨脂查尔酮可溶液剂是一种很有市场前景的防治黄瓜炭疽病的植物源杀菌剂。

关键词：植物源杀菌剂；补骨脂提取物；黄瓜炭疽病菌；抑制率

中图分类号：S436.421.1⁺9 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0160—03

黄瓜炭疽病是黄瓜叶部的重要病害，在全国各地均有发生，是世界性的农业问题。当前，生产上对黄瓜炭疽病的防治主要还是依赖于化学农药，但是化学农药防治存在成本高、农药残留、环境污染、病原抗药性增强等问题，影响着人类的身体健康，且不符合可持续发展战略的要求。陈义娟等发现茄子茎叶与辣椒茎叶提取液对黄瓜炭疽病菌具有一定的抑制效果。田菲菲等发现甘草、枸杞、金钱草等11种植物的80%乙醇提取物对黄瓜炭疽病菌都有一定程度的抑制作用。Lee等从中药石菖蒲根茎的挥发油中分离出有效成分细辛脑，且发现500μg/mL细辛脑对黄瓜炭疽病病变的形成具有很强的抑制作用。Shimizu等发现内寄生的链霉菌属MBCu-56菌株对黄瓜炭疽病有很好的防治作用，10⁹ CFU/mL菌株的防治效果为93%。本研究发现补骨脂乙醇提取物对黄瓜炭疽病菌菌丝生长、分生孢子萌发具有抑制作用，并开展了0.2%异补骨脂查尔酮可溶液剂在室内进行黄瓜炭疽病的初步防治试验，旨在为其进一步进行田问推广及应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1供试菌种和植物材料 供试菌种：黄瓜炭疽病菌（Colletrichum anthracnose），由沈阳化工大学生物工程教研室保存。

供试黄瓜品种：冠军密刺。

1.1.2供试药剂 95%乙醇（沈阳市新化试剂厂）；琼脂（福建省泉州市泉港化工厂）；葡萄糖（国药集团化学试剂有限公司）；0.2%异补骨脂查尔酮可溶液剂（补骨脂提取物质量浓度为10%，沈阳化工大学生物工程教研室制备）；75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂（有效成分含量75%，拜耳作物科学公司）。

1.1.3主要仪器LDZX-40BI立式自动电热压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；PH140A型光照培养箱/干燥箱（上海益恒实验仪器有限公司）；HNP-1S水平流形超净工作台（南通沪南科学仪器有限公司）；SCOUT电子天平SCA210（叟豪斯国际贸易有限公司）；METILER AE240s电子分析天平（特勒-托利多仪器有限公司）；LRH-280微电脑控制生化培养箱（广东省医疗器械厂）；MOTIC BA220型显微镜（上海精密仪器仪表有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1补骨脂提取物的制备 提取溶剂为70%乙醇、固液比为1 g：5 mL、提取温度为室温、提取时间每次为3 h、合并滤液次数为2次以上，将所得的乙醇提取液在60℃下用旋转蒸发仪进行蒸馏浓缩，然后再在真空干燥箱内进行干燥。将干燥后的植物提取物密封好后，放人4℃冰箱内保存备用。

1.2.2补骨脂提取物对黄瓜炭疽病菌菌丝生长抑制作用测定 采用菌丝生长速率法。用乙醇将补骨脂膏完全溶解分别配成浓度为243、81、27、9、3 mg/mL的溶液。取上述配制的5个浓度的溶液各1 mL，分别加入到100 mL，在50℃左右的PDA培养基中。充分混匀后，即配制成所设浓度含药培养基，将1 mL的乙醇溶液加入到100 mL PDA培养基中作为对照，然后倒入直径为90 mm的培养皿中制成平板，备用。使用直径为6 mm的打孔器在事先在PDA平板上打孔，将在28℃下培养了3～5 d的供试病菌菌落边缘处切取菌饼，并且接种到不同浓度的补骨脂平板和对照平板中央，每次处理重复4次，置于28℃下培养5～7 d，测量菌落的直径。每种菌落取相交垂直線方向测其直径，以其均值减去菌饼直径即得菌落净生长直径。

1.2.3补骨脂提取物对黄瓜炭疽病菌孢子萌发的抑制作用测定 将黄瓜炭疽病菌菌饼放置于菜豆培养基平板中央，置于28℃下培养7～10 d，待菌丝长满后，取长势良好的黄瓜炭疽病菌平板，加5 mL 1%的无菌葡萄糖水，用毛刷刷洗病原菌平板，8层纱布过滤，用1%的葡萄糖水溶液调至每个视野15～20个孢子，制备成孢子悬液。移取190μL的孢子悬液至32微孔板，加入10μL一定浓度的补骨脂乙醇溶液，使补骨脂提取物的终浓度为3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg/L。加入等量的乙醇为对照，等量1%葡萄糖水为空白，每个处理重复3次。每隔2 h镜检孢子萌发的状态。当空白孢子萌发率达到90%时，每处理随机选取200个孢子，并以芽管长度超过孢子短径的1/2时视为萌发，统计孢子萌发率，并计算抑制率。

1.2.4室内盆栽试验 将芽势一致的黄瓜种子播种在花盆中，当植株长到2叶1心时，喷施不同稀释倍数的0.2%异补骨脂查尔酮可溶液剂，以75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂为对照药剂，并设清水对照。24 h风干之后，将黄瓜炭疽病菌孢子悬液均匀喷洒于植株上。接种后的试材放置在迷雾气候箱中培养；温度28～30℃，相对湿度RH为100%，接种24 h内保证黑暗条件，24 h之后光照：黑暗=12 h：12 h处理；每处理10株黄瓜苗，重复3次；待对照充分发病后调查防病效果，调查分级标准采用《农药田间药效试验》标准。

黄瓜炭疽病分级标准：0级为叶片无病斑；1级为病斑面积占整个叶面积5%以下；3级为病斑面积占整个叶面积6%～10%；5级为病斑面积占整个叶面积11%～25%；7级为病斑面积占整个叶面积26%～50%；9级为病斑面积占整个叶面积50%以上。

1.2.5数据处理 （1）独立回归方法：采用最小二乘法计算独立回归方程，计算有效抑制终浓度（EC₅₀）。（2）顯著性检验方法：采用Duncan's新复极差法在0.05水平进行显著性检验。

2结果与分析

2.1补骨脂提取物对黄瓜炭疽病菌菌丝生长的影响

补骨脂物提取物对黄瓜炭疽病菌菌丝生长的抑制率与提取物浓度呈现正相关，即随着提取物浓度的升高，抑制率也依次增高。当补骨脂提取物浓度为30、90、270、810、2 430 mg/L时，对黄瓜炭疽病菌菌丝生长的抑制率分别为47.64%、48.51%、62.50%、83.12%、91.33%。其对黄瓜炭疽病原菌EC₅₀值为62.973 mg/L，说明补骨脂提取物对黄瓜炭疽病原菌菌丝生长具有较高的抑制活性（表1）。

2.2补骨脂提取物对黄瓜炭疽病菌孢子萌发的抑制活性

补骨脂提取物的浓度与黄瓜炭疽病菌孢子萌发的抑制率呈正相关，即随着补骨脂提取物浓度升高，抑制率也增大。当补骨脂提取物的浓度为3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg/L时，其抑制率分别为16.35%、32.91%、68.38%、97.74%、98.31%。由此可以得出补骨脂提取物对黄瓜炭疽病菌抑制作用的毒力回归方程与ECso，其对黄瓜炭疽病原菌ECso值为8.213 1 mg/L（表2）。可见补骨脂提取物对黄瓜炭疽病菌的孢子具有很强的抑制作用，且随着药剂浓度的增加对孢子萌发的抑制作用明显增强。

2.3室内盆栽试验结果

室内盆栽试验发现，0.2%异补骨脂查尔酮可溶液剂对黄瓜炭疽病有明显的防治效果，且防治效果与可溶液剂的稀释倍数呈现正相关，其中3 000倍液的防效为59.08%，防效好于75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂的效果（表3）。结果表明，0.2%异补骨脂查尔酮可溶液剂对黄瓜炭疽病有很显著的防效，且其药效要好于75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂。室内盆栽试验为能够进行田问实验或是真正应用于实际生产中防治黄瓜炭疽病提供一定的数据支持与理论依据。

3讨论

本研究通过菌丝生长速率法及孢子萌发法测定了补骨脂提取物对黄瓜炭疽病菌的抑制作用，发现抑制中浓度EC₅₀分别为62.973、8.213 mg/L，说明补骨脂提取物对黄瓜炭疽病菌有极强的抑制作用。最后通过盆栽试验，测定了0.2%异补骨脂查尔酮可溶液剂对黄瓜炭疽病的防治效果，结果表明0.2%异补骨脂查尔酮可溶液剂对黄瓜炭疽病具有很好的防效。

目前国内外对黄瓜炭疽病的防治，特别是植物源杀菌剂的研究较少，本研究首次发现补骨脂提取物对黄瓜炭疽病菌具有显著的抑制效果。以往的报道中，陈义娟等发现茄子茎叶和辣椒茎叶的乙醇提取液对黄瓜炭疽有显著的抑菌作用，当浓度为20 g/L时，其对黄瓜炭疽病菌菌丝的抑制率分别为72.86%、72.57%，EC₅₀依次为6.962 7、8.254/L。在本研究中当补骨脂提取物浓度为2.43g/L时，对黄瓜炭疽病菌菌丝的抑制率为91.33%，其中ECso为62.973 mg/L。田菲菲等发现甘草的乙醇提取物的质量浓度为10 g/L时，对黄瓜炭疽病菌分生孢子萌发的抑制率达99.6%。在本研究中，补骨脂提取物的浓度为50 mg/L时，抑制率为98.31%。可见，补骨脂提取物对黄瓜炭疽病菌菌丝生长、孢子萌发均有很强的抑制作用

本试验结果表明，补骨脂对黄瓜炭疽病菌具有很强的抑制作用，且补骨脂制剂作为植物源杀菌剂，它的作用靶标或对病原菌的作用一般都是多因子的，故不易使靶标菌产生抗药性。因此，补骨脂作为一种绿色环保的植物源农药对防治黄瓜炭疽病具有很好的应用前景。本研究为田问药效实验及补骨脂的推广利用提供了理论依据。