日本荚蒾叶片中乙酰胆碱酯酶抑制物的提取工艺优化＊

杨慧霞，陈欣雨，杨晨娜，杜灵洁，胡秀荣，边才苗

（台州学院 生命科学学院，浙江 台州 318000）

阿尔茨海默病（AD）是一种发生于老年和老年前期以进行性神经退化为特征的退行性疾病，临床上有记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍，以及人格和行为改变等全面性痴呆表现，最终可导致死亡［1-2］。随着人口老龄化的出现，AD疾病已成为诸多学者关注的第四大疾病。研究表明AD是一种多病因疾病，临床上主要依据为“胆碱能缺失学说”［3］，认为大脑内神经递质-乙酰胆碱的缺失是导致AD疾病的关键原因。乙酰胆碱酯酶（AChE）催化乙酰胆碱的裂解反应，导致乙酰胆碱的缺失、神经信号传递失败。目前对AD的药物治疗多采用胆碱酯酶抑制剂（AChE I）抑制AChE活性，以延缓乙酰胆碱的水解速度［4］。

诸多植物的药用成分对AD具有疗效好、副作用小、作用面广、适宜长期服用等优点。因而从药用植物中寻找具有抗老年性痴呆的乙酰胆碱酯酶抑制剂，已成为当今医药研究方面的热点课题［5-9］。植物来源的天然产物中有AChE抑制活性的生物碱种类丰富，主要包括甾体类、三萜类、石松碱类、异喹啉类和吲哚类生物碱［8，9］。

日本荚蒾（Viburnum japonicum）为忍冬科（Caprifoliaceae）荚蒾属植物，主要生长在海岛低海拔杂木林中，为常绿的灌木或小乔木。日本荚蒾在日本和中国呈间断分布，在中国大陆分布范围十分狭窄，仅见于浙江省台州市椒江区的上大陈岛，临海市的头门岛、雀儿岙等海岛，以及舟山东福山岛（图1），目前数量稀少，属浙江省首批重点保护野生植物［10］。荚蒾属植物所含的物质成分复杂，具有抗氧化、止咳化痰、消炎抗菌、治疗月经不调、胃肾绞痛等功效［11］。预实验结果表明，日本荚蒾叶片和果实中含有乙酰胆碱酯酶抑制剂。为此，本文以日本荚蒾的成熟叶片为材料，测定了其提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制率，并对乙酰胆碱酯酶抑制剂的提取工艺进行了优化。

图1 日本荚蒾、日本荚蒾分布区域、我国日本荚蒾分布区域

1 材料与方法

1.1 材料来源

日本荚蒾成熟叶片，采摘于浙江省台州学院临海校区珍稀植物种植园，采摘时间为2017年11月下旬，清水冲洗后，经真空冷冻干燥、研碎后，置于密闭的玻璃瓶内4℃保存，备用。

1.2 研究方法

1.2.1 不同溶剂提取液的制备

在三个锥形瓶中各加入10.0 g研碎的日本荚蒾叶片样品，分别加入水、甲醇和80%的乙醇100 mL，混匀后60℃回流提取2 h，过滤；将滤液用旋转蒸发仪浓缩成浸膏，真空干燥后4℃保存备用。

使用前将浸膏用50%乙醇配制成1.0 mg/mL的稀释液，按照乙酰胆碱酯酶试剂盒说明书测定乙酰胆碱酯酶抑制率，其中提取物的稀释液作为抑制剂使用。

计算公式［12，13］：抑制率=（测定OD值-对照OD值）/（标准OD值-空白OD值）

1.2.2 不同乙醇浓度提取液对乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制率的影响

取5份10.0 g研碎的日本荚蒾叶片样品，分别与100 mL浓度为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液混合，在60℃回流提取2 h，过滤；将滤液用旋转蒸发仪浓缩成浸膏，真空干燥后4℃保存备用。随后的处理和测定同1.2.1。

1.2.3 不同温度提取对AChE抑制率的影响

取5份10.0 g研碎的日本荚蒾叶片样品，与100 mL 80%乙醇溶液混合，分别在40℃、50℃、60℃、70℃和80℃条件下回流提取2 h，过滤；将滤液用旋转蒸发仪浓缩成浸膏，真空干燥后4℃保存备用。随后的处理和测定同1.2.1。

1.2.4 不同时间提取对AChE抑制率的影响

取5份10.0 g研碎的日本荚蒾叶片样品，与100 mL 80%乙醇溶液混合，在60℃条件下分别回流提取60、90、120、150和180 min，过滤；将滤液用旋转蒸发仪浓缩成浸膏，真空干燥后4℃保存备用。随后的处理和测定同1.2.1。

1.2.5 粗提物的萃取处理

取3份10.0 g研碎的日本荚蒾叶片样品，按照优化的提取程序制备粗提液，滤液用旋转蒸发仪浓缩成浸膏，将所得浸膏加入20 mL蒸馏水，再分别加入30 mL石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每份各萃取3次，合并3次萃取液，经旋转蒸发仪浓缩成浸膏，真空干燥后4℃保存备用。随后的处理和测定同1.2.1。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂提取液的AChE抑制率

不同溶剂提取液对AChE的抑制率见表1，结果显示，用乙醇作为提取溶剂时，提取液对AChE的抑制率最高，甲醇提取液的抑制率其次，水提取液的抑制率很低，三者的差异均为极显著（p＜0.01），可选择乙醇作为提取溶剂。

表1 不同溶剂的提取液对AChE的抑制率（1.0 mg/mL）

2.2 不同乙醇浓度提取液对AChE抑制率的影响

不同乙醇浓度的日本荚蒾叶片提取液对AChE的抑制率见图2。结果显示，乙醇浓度80%时，提取液对AChE的抑制率最高；乙醇浓度60%～90%时，提取液的抑制率差异不显著；乙醇浓度为50%时，提取液的抑制率最低，与乙醇浓度为80%时的差异显著（p＜0.05）。

图2 不同乙醇浓度提取液的AChE抑制率

2.3 不同提取温度提取液对AChE抑制率的影响

不同提取温度下，日本荚蒾叶片提取液对AChE的抑制率见图3。结果显示，在提取温度60℃时，提取液对AChE的抑制率最高；提取温度为50～70℃时，抑制率差异不显著；而提取温度为40℃时和80℃时的抑制率均较低，与提取温度为60℃时的差异显著（p＜0.05）。

图3 不同提取温度提取液的AChE抑制率

2.4 不同提取时间提取液对AChE抑制率的影响

不同提取时间下，日本荚蒾叶片提取液对AChE的抑制率见图4。结果显示，在提取时间120 min时，提取液对AChE的抑制率最高；提取时间为90～180 min时，提取液的抑制率之间差异不显著（p＞0.05）；而提取时间为60 min时抑制率最低，与提取时间为120、150和180 min时的抑制率差异均为显著（p＜0.05）。

图4 不同提取时间提取液的AChE抑制率

综合2.2～2.4的实验结果，日本荚蒾叶片中AChE抑制物回流提取的最佳工艺是：提取溶剂为80%乙醇、提取温度为60℃、提取时间为120 min。

2.5 不同有机溶剂萃取组分对AChE抑制率的影响

不同有机溶剂萃取组分对AChE的抑制率见表2。结果显示，石油醚萃取相的抑制率最高，乙酸乙酯萃取相的其次，两者均高于对照（未萃取的提取液），其中石油醚萃取相与对照的差异为显著（p＜0.05）；正丁醇萃取相的抑制率较低，与其他2种萃取相和对照的抑制率差异均为极显著（p＜0.01）。提示从石油醚相和乙酸乙酯相中有可能存在活性更强的AChE抑制成分。

表2 不同有机溶剂萃取组分对AChE的抑制率（1.0 mg/mL）

3 讨论与结论

随着社会人口的老化，AD症的发病率相对增高。目前，全世界约有1700万以上人患有此症［12］。因此，有必要从植物中提取和纯化出高效的AChE抑制物。本文的研究表明，日本荚蒾叶片中有丰富的AchE抑制物，用乙醇提取效果较好，最适提取条件为：乙醇浓度80%、提取温度60℃、提取时间120 min。再者，比较不同溶剂萃取组分的抑制率，显示石油醚相和乙酸乙酯相的抑制率较高，显著高于未萃取的对照；而正丁醇相的抑制率相对较低。提示对AChE具抑制作用的有效成分可能是低极性的。已有文献［12-14］报道，含氧低、极性小的萜类、甾体，生物碱等对AchE有抑制活性。因此，从石油醚相和乙酸乙酯相中很可能存在活性更强的有效成分，有利于AD症高效防治药物的开发。