紫苏叶中α-淀粉酶抑制剂的提取工艺研究

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢疾病。近几十年来，糖尿病患者的比例逐渐提高，90%以上的患者被诊断为2型糖尿病。糖尿病易引发各种并发症，如神经病变、肾病、肝损伤等[1]。因此，抑制或延缓糖尿病并发症的有效途径之一是通过抑制α-淀粉酶的活性来减缓葡萄糖的形成[2]。α-淀粉酶抑制剂（α-Amylase Inhibitor，α-AI）主要作用于人体的胃肠道，通过抑制α-淀粉酶的活性来延缓和阻碍碳水化合物的消化吸收，从而使血糖浓度降低[3]。目前，临床上常用的降糖药物有一定的治疗效果，但易产生副作用。因此，研究者开始从植物中开发绿色安全、副作用小的α-淀粉酶抑制剂[4]。

紫苏（Perilla frutescensL.）是一种药食同源的中草药，有近2000年的栽培历史[5]。紫苏全身是宝，其叶、茎和种子均可入药，而叶子为最常用入药器官。研究表明紫苏具有抗氧化、治疗心血管疾病、降血糖等活性，这些功能与其含有多种生物活性成分有关，如酚酸类、黄酮类、多糖类等[6-7]。因此，本研究以紫苏叶为实验原料，采用乙醇浸提的方法提取紫苏叶中具有α-淀粉酶抑制活性的物质，并通过正交实验对其提取工艺条件进行优化，为更好地开发利用紫苏叶提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫苏叶购自于广东省揭阳市；3,5-二硝基水杨酸；猪胰腺α-淀粉酶；可溶性淀粉；无水乙醇等。

1.2 仪器与设备

FLUOstar Omega多功能荧光酶标仪，德国BMG LABTECH公司；RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；H2050R高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司等。

1.3 实验方法

1.3.1 紫苏叶预处理

先用自来水冲洗新鲜的紫苏叶片表面，再用蒸馏水清洗，自然风干，鼓风干燥箱60 ℃烘10 h。多功能粉碎机粉碎后过60目标准筛，装自封袋中4 ℃保存备用。

1.3.2 紫苏叶α-淀粉酶抑制剂的提取工艺

准确称取3 g过筛后的粉末，加入一定体积的乙醇溶液，在恒定温度下浸提一段时间。利用超声波辅助提取30 min，10 000 r·min-1离心15 min，得到的上清液经旋转蒸发仪浓缩，用蒸馏水将不同实验条件下获得的紫苏叶提取液定容至相同体积。

1.3.3 单因素实验

采用上述提取方法，分别在不同料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25）、不同提取温度（50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃）、不同乙醇浓度（10%、30%、50%、70%和90%）、不同提取时间（10 min、30 min、50 min、70 min和90 min）条件下进行浸提，探讨上述因素对α-AI的抑制率的影响。

1.3.4 正交实验

在单因素实验的基础上，选取料液比、提取温度、乙醇浓度和提取时间这4个因素为自变量，α-AI的抑制率为因变量，采用L9(34)正交实验法，确定α-AI的最优提取条件。

1.3.5 α-AI活性测定

参考赵蓉等[8]的方法测定紫苏叶提取物中α-AI的活性。将0.25 mL的紫苏叶提取样液与0.25 mL猪胰腺α-淀粉酶稀释液（1.5 U·mL-1）混合，加入0.5 mL PBS溶液，37 ℃水浴10 min。加入0.5 mL 0.1%可溶性淀粉，37 ℃水浴反应5 min。加入DNS试剂1 mL，沸水浴10 min，冷却至室温，540 nm处测定吸光值。α-AI的抑制率为

式中：A1、A2、A3和A4分别为空白管、空白对照管、抑制管和抑制对照管的吸光值。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对α-AI的抑制率的影响

由图1可知，随着料液比的增大，提取液中α-AI的抑制率逐渐增大，当料液比为1∶20（g∶mL）时α-AI的抑制率最好。说明适当增加提取剂的用量，可以增大提取剂与α-AI的抑制率成分的接触面积，有利于提取物中α-AI的抑制率成分的扩散，便于α-AI的抑制率成分的溶出，从而提高其抑制率[9]。继续提高料液比，α-AI的抑制率反而下降。因为增加了提取液的体积，α-AI在体系中的浓度逐渐降低，从而导致其抑制率下降。因此最佳料液比为1∶20（g∶mL）。

图1 料液比对α-AI的抑制率的影响图

2.1.2 提取温度对α-AI抑制率的影响

由图2可知，随着温度的升高，提取液中α-AI的抑制率逐渐增大，温度达到60 ℃时，α-AI的抑制率最好。此后随温度的增加抑制率反而下降。因为温度对α-AI的溶解度会产生一定影响，升温会使分子热运动逐渐加快，同时也会提高提取剂的扩散速度，加大提取剂对α-AI的溶解度[10]，利于提取物中降血糖的活性物质得到释放。但过高的温度可能会导致α-淀粉酶抑制剂的稳定性受到影响，同时α-AI成分也会部分失活，从而变性析出，降低其活性[9]。因此最佳提取温度为60 ℃。

图2 提取温度对α-AI的抑制率的影响图

2.1.3 乙醇浓度对α-AI抑制率的影响

由图3可知，乙醇浓度在10%～70%，提取液中α-AI的抑制率随着浓度的增加而升高，当乙醇浓度为70%时α-AI的抑制率达到最大，提取效果最好，之后逐渐下降。可能是因为乙醇浓度的提高，会增大提取剂对细胞的渗透作用[6]，有利于α-AI的抑制率成分从细胞中释放出来，从而提高提取物中α-AI的抑制率。当乙醇的浓度增加到一定程度后，物料中水的比例降低，会阻碍α-AI的溶出，从而影响其得率，α-AI的抑制率不升反降[10]。因此最佳乙醇浓度为70%。

图3 乙醇浓度对α-AI的抑制率的影响图

2.1.4 提取时间对α-AI抑制率的影响

由图4可知，随着提取时间的延长，提取液中α-AI的抑制率逐渐提高，浸提时间为70 min时，α-AI的抑制率最好。说明在浸提初期，延长提取时间有利于α-AI的析出。当活性成分在细胞内外趋于平衡时，继续增加浸提时间，提取液中能够抑制α-AI活性成分的物质浓度在增加，溶出物中α-AI活性成分所占的比例降低[11]。因此最佳提取时间为70 min。

图4 提取时间对α-AI的抑制率的影响图

2.2 正交实验结果分析

在单因素实验的基础上，采用L9(34)正交实验法，因素与水平设计见表1。由表2可知，根据K值确定α-淀粉酶抑制剂提取的最优水平组合为A2B2C2D2，即料液比为1∶20（g∶mL），提取温度为60 ℃，乙醇浓度为70%，提取时间为70 min。为进一步确定制备α-淀粉酶抑制剂的最佳工艺条件，对正交实验的提取条件A2B2C2D2进行验证。结果表明，α-淀粉酶抑制剂的抑制率平均值为59.12%。说明不同因素之间会存在一定的相互促进作用，优化后α-AI的抑制率有所提高。

表1 正交实验因素与水平表

表2 正交实验结果表

续表2

3 结论

本实验探讨了料液比、提取温度、乙醇浓度和提取时间对紫苏叶提取物中α-AI的抑制率的影响，在单因素实验基础上，优化了α-AI的提取条件。影响α-AI的抑制率的因素依次为料液比＞乙醇浓度＞提取温度＞提取时间。α-淀粉酶抑制剂提取的最优水平组合为A2B2C2D2，即料液比为1∶20（g∶mL），提取温度为60 ℃，乙醇浓度为70%，浸提时间为70 min，得到的α-淀粉酶抑制剂的抑制率为59.12%。