ku80蛋白表达水平与肝癌细胞侵袭迁移能力的相关性

王宁 张帅民 王常元 徐贤刚 黎涛 王飞清 李克跃 刘振华

(1贵州省骨科医院药剂科，贵州 贵阳 550002；2贵州大学附属人民医院肝胆外科；3贵阳中医学院第一附属医院检验科)

原发性肝癌(PHC)是全世界最常见、排名第六位的癌症，也是癌症相关死亡的第四大常见原因〔1〕。肝癌术后常出现转移、复发，成为其高死亡率的主要原因之一，虽治疗手段取得了极大进步，但其疗效仍不理想〔1,2〕。根本原因是缺乏防治肝癌转移复发的有效手段及确切的治疗靶标〔3〕。研究发现ku80蛋白在多种肿瘤中异常表达，在肿瘤细胞黏附、迁移及侵袭中发挥重要作用〔4～6〕，然而其在肝癌细胞系中表达、表达部位与肝癌细胞系的迁移、侵袭能力是否具有相关性仍不清楚。本文拟分析ku80蛋白表达水平与肝癌细胞侵袭迁移能力的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞系MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2和正常人肝细胞HL-7702购于中国科学院上海生命科学院细胞库，兔ku80单克隆抗体(EPR3467)、羊抗兔Alexafluor®488荧光标记二抗均购于艾博抗(上海)贸易有限公司。ku80引物由上海吉玛生物技术公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2、HL-7702使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养，放置37℃、5%CO2孵箱中孵育，每2 d换培养基一次，细胞密度达到80%，进行后续实验的处理。

1.2.2 Western印迹检测蛋白水平 冰上裂解细胞30 min，收集裂解细胞悬液至1.5 ml离心管，14 000 r/min，4℃ 离心20 min。二喹啉甲酸(BCA)法定量各组样品蛋白，用上样缓冲液进行样品制备，上样行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿转法转印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉常温下封闭2 h，4℃冰箱中一抗孵育过夜，洗膜液洗3次，每次10 min，用二抗室温孵育1.5 h，进行化学发光显色，化学发光及凝胶成像仪观察各组细胞ku80蛋白水平。

1.2.3 Real-time(RT)PCR 提取各细胞系RNA，并使用M-MLV逆转录酶系统进行逆转录。 筛选最有效的ku80引物序列为5′-TGACTTCCTGGATGCACTAATCGT-3′(正义链);5′-TTGGAGCCAATGGTCAGTCG-3′(反义链)。内参β-actin正义链：5′-GGCGGCACCATGTACCCT-3′;反义链：5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。LightCycler 480仪用于PCR(先95℃ 30 s，然后94℃ 30 s、30℃ 60 s、72℃ 30 s)，进行45个循环。72℃延伸7 min，PCR在4℃终止。 使用LightCycler 480软件1.5分析mRNA表达作为校准物标准化比率。预实验验证目的基因扩增效率与内参一致。

1.2.4 细胞划痕实验 待细胞生长至最佳，每孔3×105个/ml细胞接种于6孔板，次日长满后，用20 μl的加样枪头轻轻划一痕，0 h、72 h时间点测量划痕宽度算出细胞迁移率。

1.2.5 细胞侵袭实验 Transwell小室上层采用Matrigel胶与减血清培养基按1∶6比例混合，每孔100 μl铺成单层，37℃温箱孵育30 min； 每孔5×105个/ml，取300 μl细胞悬液接种于Transwell小室，置于24孔板中，下室加含10%胎牛血清的培养基，培养24 h后，用棉签在小室内层轻轻擦试胶，苏木素染色10 min，伊红紫染色8 min，75%酒精洗2次，每次2 min。随机取5个视野，计数细胞穿膜数。

1.2.6 免疫荧光检测亚细胞定位 将爬好细胞的

玻片在培养板中用磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗细胞3次，每次3 min。4%多聚甲醛固定细胞15 min。用PBS(含0.2% 曲拉通X-100)通透20 min。以山羊血清非特异性封闭1 h。室温下ku80一抗在湿盒中孵育2 h。二抗避光孵育细胞1 h。DAPI复染细胞5 min。PBS漂洗细胞后荧光显微镜下观察。

1.3 统计处理 采用SPSS17.0软件，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，行直线相关性分析。

2 结 果

2.1 ku80 mRNA在各细胞系中的表达水平 ku80 mRNA在HL-7702和3株肝癌细胞MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2中均可检测到，并且3株肝癌细胞ku80 mRNA水平明显高于正常肝细胞HL-7702(P<0.05，P<0.01)。见表1。

2.2 ku80蛋白在各细胞系中的表达 ku80蛋白在正常肝细胞及3株肝癌细胞中均有表达，且相比正常肝细胞HL-7702,各肝癌细胞系ku80蛋白的表达升高明显(P<0.05)，其中在MHCC97-H细胞中表达量最高(P<0.01)(图1，表1)。

图1 ku80蛋白在各细胞系中的表达

表1 各细胞系ku80的表达水平及侵袭迁移能力

与HL-7702比较：1)P<0.05，2)P<0.01

2.3 肝癌细胞体外迁移能力 相比正常肝细胞HL-7702,各肝癌细胞系具有明显迁移能力(P<0.05)，其中MHCC97-H细胞在同时间内迁移率与正常肝细胞比较差异更显著(P<0.01)(表1，图2)。

2.4 肝癌细胞体外侵袭能力 各细胞系均有不同程度侵袭能力。与正常肝细胞HL-7702相比，MHCC97-L、HepG2肝癌细胞系的穿膜细胞数差异有统计学意义(P<0.05)，MHCC97-H细胞穿膜细胞数差异更显著(P<0.01)(表1，图3)。

2.5 ku80蛋白亚细胞定位 通过免疫荧光技术检测MHCC97-H细胞中ku80的亚细胞定位发现，绿色标记的ku80蛋白主要在细胞核中表达，在细胞质中亦有散在分布(图4)。

2.6 ku80蛋白、mRNA表达量与肝癌细胞系迁移、侵袭能力的相关性分析 ku80蛋白水平与肝癌细胞的迁移、侵袭能力呈正相关(r=0.83，F=50.03，P<0.01；r=0.94，F=159.70，P<0.01)；ku80 mRNA的表达水平亦与肝癌细胞系的迁移、侵袭性呈正相关(r=0.86，F=61.49，P<0.01；r=0.87，F=69.18，P<0.01)(图5)。

图2 肝癌细胞迁移能力(×40)

图3 肝癌细胞侵袭能力(×100)

图4 MHCC97-H细胞ku80免疫荧光亚细胞定位

图5 ku80蛋白、mRNA表达水平与肝癌细胞系迁移、侵袭能力的相关性

3 讨 论

肝细胞性肝癌(HCC)往往合并肝硬化，对肝硬化患者进行规律的超声筛查可以有效地发现早期肝癌并有益于提高生存率〔7,8〕。外科治疗如肝叶切除、肝移植、射频消融、介入栓塞的治疗有其各自的适应证与局限性。研究发现辅以中医中药治疗亦可收到一定效果〔9〕，索拉非尼一定程度上能使晚期肝癌患者的生存获益〔10〕。然而，探索有效的治疗药物靶点，达到精准治疗，防治肝癌转移、复发是目前面临的重要难题。

ku80是ku蛋白复合物的一个亚基，ku蛋白家族是在原核生物和真核生物中发现的丰富、高度保守的DNA结合蛋白，在维持基因组完整性中起重要作用〔11〕。ku80蛋白由XRCC5基因编码，与 ku70共同构成ku70/ku80异源二聚体，是一种DNA依赖性蛋白激酶复合物(DNA-PK)。ku80蛋白的显著特征在于其作为“经典”非同源末端连接(C-NHEJ)途径中的初始DNA末端结合因子发挥中心作用，直接或间接地与几种非同源末端连接因子和加工酶相互作用，作为整个DNA修复复合物的支架参与DNA双链断裂修复〔12,13〕。还有证据表明ku参与DNA损伤应答机制的信号传导，以调节细胞周期检查点的激活和细胞凋亡的激活〔14〕。

ku的功能对于维持基因组完整性和适当的细胞和生物发育至关重要〔15〕。ku80作为ku发挥功能的重要亚基，在肿瘤的发生发展中可能发挥重要作用。研究发现ku80在肺癌组织中过表达,在非小细胞肺癌细胞中，敲低ku80，可在体外和体内抑制肿瘤特性〔16〕。肺腺癌的组织芯片免疫组织化学分析显示ku80和环氧化酶(COX)-2水平与临床病理特征之间存在强烈的正相关，ku80过度表达的肺癌患者预后不佳，ku80促进COX-2表达和肿瘤生长，并且可能是肺癌的潜在治疗靶标〔17〕。既往研究表明，DNA双链断裂修复蛋白ku80对顺铂联合放射治疗宫颈癌亦具有增敏作用〔18〕。热疗作为抗癌方法受到越来越多的关注，ku80可能通过影响细胞周期分布在高温诱导的肾癌细胞凋亡和热敏感性中发挥重要作用〔19〕。在局部进展的食管癌研究中发现，高表达ku80往往预示着更差的预后〔20〕。

总之，ku80可能参与了肿瘤的发生发展过程。ku80蛋白主要在细胞核表达，其表达水平与肝癌细胞系的迁移、侵袭能力呈正相关。鉴于ku80在肿瘤发展中的重要作用，有望成为肝癌的潜在治疗靶标。