miR-129对阿尔茨海默病细胞模型的调控作用

周宜灿 潘晓东

(福建医科大学附属协和医院神经内科，福建 福州 350001)

阿尔茨海默病(AD)是与年龄有关的神经退行性障碍疾病，起病隐匿，病程缓慢且不可逆。临床表现为认知能力的下降、记忆力下降及人格和行为改变等全面性痴呆表现，分为早老性痴呆和老年性痴呆〔1～3〕。AD的主要病理学改变为脑中神经突起-淀粉样斑块(NP)沉积及神经纤维缠结(NFT)。其中β淀粉样蛋白(Aβ)为沉淀的主要成分，是由淀粉样前体蛋白(APP) 经 β-和 γ-分泌酶的蛋白水解作用而产生。Aβ1～40和Aβ1～42是最常见的Aβ亚型，但是Aβ1～42更容易形成Aβ的核心从而造成毒性损害〔4〕。miRNA是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小为20～25个核苷酸，miRNAs涉及多种生理过程的发生及脂肪的代谢，包括生命的发育、机体免疫、细胞增殖与凋亡〔5〕。研究表明，miR-129与多种实体肿瘤疾病有关，如乳腺癌，胃癌〔6〕；同时也与神经系统的疾病发生发展有关，如胶质瘤等。本研究运用新生大鼠原代神经元细胞于体外建立AD细胞模型，拟观察miR-129在其发生发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 取出生24 h内新生健康SD大鼠，酒精消毒，断头取脑组织并将其至于预先准备好的Hank平衡盐溶液(HBSS)中，分离双侧海马，剔除表面脑膜及血管组织，加入0.125%胰蛋白酶，置于37℃ 水浴振荡消化10 min，吸除胰蛋白酶，HBSS洗涤2次，加入适量培养基重悬，70 μm筛网过滤，接种于高糖DMEM培养基(10%胎牛血清、1%丙酮酸钠、1% GlutaMax)，贴壁后，更换培养基。Aβ处理构建AD细胞模型。细胞分为对照组、模型组、miR-129敲低组、miR-129过表达组、miR-129敲低+Aβ处理组、miR-129过表达+Aβ处理组、APP siRNA组。细胞转染采用Lipofectamine2000。miR-129过表达载体(pGCMV/EGFP/miR-129)及对照载体(pGCMV/EGFP/miRNC)均由上海吉玛公司构建。

1.2 Q-PCR检测APP mRNA表达水平 各组细胞处理完毕后，Trizol(Invitrogen，美国)裂解提取RNA，以25℃ 10 min,50℃ 30 min,85℃ 5 min为条件逆转录RNA为cDNA，以cDNA作为模板完成实时荧光定量PCR。基因的引物采用Primer5.0软件设计。miR-129引物为通用引物，APP上游引物：5′-GGGTAGAGTTTGTGTGTTGCC-3′;下游引物：5′-TCTTCTTCCACCTCAGCCAC-3′。

1.3 膜联蛋白(Annexin)V-碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡 运用Annexin V-FITC/PI (碧云天，C1062)双染检测各组凋亡率，各组细胞处理完毕，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，收集上清液离心，接着使用浓度为0.25%不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化细胞，制备单细胞悬液浓度1×106个细胞/ml，2 000 r/min离心5 min，PBS洗涤2次，收集细胞，用200 μl缓冲液重悬，分别加入5 μl FITC和10 μl PI，4℃避光孵育15 min。用PBS将悬液补充至700 μl，上机检测。

1.4 噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖率 消化处于对数期的神经元细胞，接种于96孔板中，保持细胞浓度5×103/孔，培养24 h后，换液。每组设置3个副孔，培养24 h，加入MTT(5 g/L，碧云天，C0009)各20 μl，4 h 后吸出培养液，接着加入二基亚砜(DMSO)150 μl，轻微振荡5 min溶解结晶，同时注意避光，最后在570 nm 波长下测吸光度(C)值。

1.5 Western印迹检测蛋白水平表达 放射免疫沉淀(RIPA)1640(碧云天，P0013B)强裂解液提取细胞总蛋白。采用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法测定蛋白浓度，并将蛋白于-80℃冰箱保存。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿转转模，封闭后，孵育一抗，4℃冰箱过夜。次日孵以二抗，冷CCD成像系统观察蛋白表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS21.0软件进行F检验和q检验。

2 结 果

2.1 Aβ处理与miR-129表达水平的关系 用10 μmol/L Aβ分别处理常用的神经细胞株PC12及海马神经元细胞24 h，模型组miR-129表达水平(0.35±0.03、0.31±0.02)显著低于对照组(1.05±0.02、1.08±0.01，t=3.62、3.99，P<0.05)。

2.2 各组凋亡率与细胞活力比较 模型组凋亡率(40.91%)明显高于对照组(4.05%,P<0.05)，miR-129过表达+Aβ处理组(22.47%)、miR-129敲低+Aβ处理组(48.16%)与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。模型组细胞活力(44.36%)显著低于对照组(92.89%)，miR-129过表达+Aβ处理组(55.46%)、miR-129敲低+Aβ处理组(39.23%)与模型组差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.3 miR-129 过表达与APP mRNA的关系 miR-129过表达组APP mRNA(0.60±0.02)显著低于对照组(1.80±0.01，P<0.05)，见图2。

2.4 抑制APP表达后神经元细胞凋亡的比较 模型组凋亡率(53.71%)显著高于对照组(4.60%，P<0.05)。APP siRNA组(20.54%)显著低于模型组(P<0.05)。见图3。

图1 各组凋亡率比较

图2 miR-129 过表达与APP mRNA的关系

图3 抑制APP表达后神经元细胞凋亡的比较

3 讨 论

AD是一种与年龄相关的退行性疾病，主要的病理特征为集中在大脑海马区的Aβ在细胞外沉积形成老年斑(SP)，而β分泌酶(BACE1)是Aβ生成的限速酶〔7〕。tau蛋白的过度磷酸化所导致的神经细胞内神经元缠结，脑皮质神经细胞的减少及新皮层、脑血管的改变。Aβ作为机体的正常代谢物，可以由APP水解得来〔8〕。但当APP的功能出现了异常，就会导致Aβ的异常沉积，最终造成神经细胞毒性作用。同时AD也有可能由氧化应激和炎症所导致〔9〕。

miRNA是约含有22个核苷酸的非编码RNA，可以通过调节相应的靶基因参与到分化发育、细胞增殖凋亡等过程中。组织或血清中miRNA的异常表达在恶性肿瘤的发生和进展中起重要作用〔10〕。而中枢神经系统的miRNA则可能参与了神经系统的发育和功能。研究表明miRNA在调控AD 等神经退行性疾病的发病中起重要作用，且miRNAs 网络的改变增加了AD的发生风险〔11〕。有研究表明，miRNA-129在胃癌组织中异常表达，其表达水平与晚期胃癌患者预后显著相关，其表达水平可作为潜在的胃癌预后判断指标，也可作为化疗法的潜在评价指标〔12〕，说明miR-129具有多种生物学功能。本研究通过培养海马神经元原代细胞，运用Aβ来进行体外AD模型的构建，结果说明miR-129参与了AD的过程。miR-129可能通过抑制APP的活性来减少Aβ造成的神经细胞毒性作用。

综上，miR-129在AD模型中处于一个低表达状态，但当过表达miR-129后可以有效减轻神经元细胞的凋亡，且可能通过抑制APP的活性来减少Aβ造成的神经细胞毒性作用。