高密度脂蛋白模拟肽修复肿瘤坏死因子α诱导的内皮祖细胞损伤

王凤娇 高翔 孔淑琦 张建林 刘祺 尹航 王梦洁 王晓丹 牟青杰 杨娜娜

(1潍坊医学院医学研究实验中心，山东 潍坊 261000；2泰山医学院；3泰安市中心医院)

动脉粥样硬化患者循环内皮祖细胞(EPCs)较健康人明显下降〔1〕，并且EPCs增生、迁移、成血管等功能受损〔2～4〕。进一步研究发现，心脑血管疾病EPCs数量和功能与炎症等众多危险因子成负相关关系〔4〕，例如肿瘤坏死因子(TNF)-α。TNF-α是冠心病的独立危险因素之一〔5〕，能预测冠状动脉粥样硬化斑块的稳定性及急性冠状动脉综合征的严重程度〔6〕，并且明显损伤EPCs的功能〔7〕，因此如何提高心血管疾病患者EPCs功能，修复损伤血管内膜是心血管疾病前期预防和治疗的关键之一。本课题组前期研究发现，高脂饮食小鼠体内血浆TNF-α水平与体内循环EPCs数量呈负相关，且显著损伤EPCs增殖、迁移和成血管功能，高密度脂蛋白模拟肽(Rev-D4F)能显著改善TNF-α诱导的上述损伤作用〔8〕。然而Rev-D4F是否对TNF-α诱导EPCs凋亡和黏附功能的损伤具有修复作用并不清楚。本实验通过提前用Rev-D4F干预EPCs 6 h，观察Rev-D4F是否能抑制TNF-α诱导EPCs的凋亡，并修复TNF-α诱导EPCs黏附功能的损伤。

1 材料与方法

1.1 EPCs分离 4～6周龄C57小鼠麻醉后脱臼处死，75%乙醇浸泡后取股骨，用M199培养液冲洗骨髓腔，反复吹打直至冲洗液清亮，滤网过滤后冲洗液与 Ficoll分离液的体积比为1∶1，室温2 000 r/ min离心20 min，轻轻吸取中间乳白色云雾状细胞层到新的离心管中，M199清洗沉淀细胞2次，完全培养液重悬细胞，按 106/cm2的密度接种在包被Fibronectin的培养瓶中，每3 d更换条件培养基 EGM-2MV〔9〕。

1.2 EPCs鉴定EPCs 在37℃与 2.5 mg/L的DiI-acLDL孵育2 h，多聚甲醛固定后，与10 mg/L的荆豆凝集素(FITC-UEA)于37℃孵育1 h，中性甘油封片，用荧光显微镜观察。

1.3 实验分组 培养的晚期EPCs分为三组：①对照组：含5%血清的M199培养基；②TNF-α组：用含5%血清的M199培养基配置的30 ng/ml TNF-α溶液；③Rev-D4F组：用含5%血清的M199培养基配置的50 μg/ml Rev-D4F溶液干预细胞6 h后，用含5%血清的M199培养基配置的30 ng/ml TNF-α溶液处理细胞。

1.4 黏附功能检测 不同组别EPCs胰酶消化后接种于96孔培养板中，孵育 30 min，PBS 冲洗 3 次，每孔随机取 5 个视野(× 40)计数。

1.5 凋亡检测 胰酶消化细胞，1 200 r/min离心5 min，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗细胞两次，加入5 μl Annexin V-FITC，孵育10 min，加入5 μl碘化丙啶(PI)孵育5 min，加入400 μl PBS上机检测。

1.6 统计学分析 采用SPSS17.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1 EPCs型态和鉴定 根据本课题组前期对小鼠骨髓EPCs培养条件研究，采用3 d贴壁细胞继续培养，培养10 d发现克隆，继续传代培养20 d呈长梭形。见图1。培养14 d细胞进行吸附低密度脂蛋白和结合凝集素实验发现，约70%细胞能吸附低密度脂蛋白并结合凝集素(见图2)，为正在分化的EPCs。

2.2 Rev-D4F对TNF-α诱导EPCs凋亡的影响 与对照组〔凋亡率(7.9±0.33)%〕相比，TNF-α组显著促进EPCs凋亡〔凋亡率(29.7±0.75)%〕，提前6 h加入50 μg/ml Rev-D4F显著抑制TNF-α诱导的EPCs凋亡〔凋亡率(17.6±1.41)%〕，见图3。

图1 小鼠骨髓单个核细胞不同培养时间EPCs型态(×40)

图2 EPCs鉴定(×40)

图3 Rev-D4F抑制TNF-α诱导的EPCs凋亡

2.3 Rev-D4F提高EPCs黏附功能 根据前期研究结果，选取了TNF-α和Rev-D4F的剂量分别为30 ng/ml和50 μg/ml〔8〕。黏附功能检测发现，TNF-α对EPCs黏附功能并无显著影响〔TNF-α组黏附细胞数(6.9±0.83)个，对照组(6.8±0.72)个〕，Rev-D4F三组提前6 h加入50 μg/ml Rev-D4F的EPCs能显著提高EPCs的黏附功能〔(8.8±0.72)个〕。

3 讨 论

多项研究表明，体内循环中EPC数量的减少不仅与内皮功能降低有关〔4〕，而且与心血管疾病〔10,11〕、侧支形成减少〔12〕和加重心血管疾病的进程有关〔13〕。而自体EPCs移植由于存在本身功能缺陷等问题，阻碍了自体细胞治疗心血管疾病的应用，因此，EPCs移植前后的药物调节可能是提高其治疗心血管疾病潜能的一种新方法〔14〕。

Rev-D4F是一种改良的D4F，它通过抑制内皮炎症和改善高密度脂蛋白功能，降低主动脉窦动脉粥样硬化病变面积〔15〕。前期发现Rev-D4F通过磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶/内皮型一氧化氮合酶(PI3K/Akt/eNOS)途径改善小鼠骨髓来源的EPC功能，对TNF-α诱导的小鼠骨髓来源的EPC增殖、迁移和成血管功能损伤具有修复作用〔8〕，本实验前期研究基础上，继续研究Rev-D4F对TNF-α诱导的小鼠骨髓来源的EPC黏附功能和凋亡的影响。结果发现，TNF-α(30 ng/ml)促进EPCs凋亡，但TNF-α(30 ng/ml)对EPCs黏附并没有作用，Rev-D4F预先干预能明显抑制TNF-α诱导的EPCs凋亡，提高EPCs黏附功能。