LINC00612靶向结合Bcl-2抑制Aβ1-42孵育的神经元凋亡

彭 乾， 赵德丰， 张 健， 薛一雪， 姜季委， 商秀丽

阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease，AD)是一种以进行性认知障碍为主要特征的慢性退行性疾病。β-淀粉样蛋白(amyloid protein β，Aβ)沉积是AD主要的病理改变[1]。Aβ片段沉积会导致神经元凋亡，促进AD发展[2]。LncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，在AD中发挥重要作用。例如，敲减SOX21-AS1能够减弱对miR-107的分子海绵吸附作用，抑制Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞凋亡[3]；敲减SNHG1能够降低KRENEN1表达，抑制Aβ25-35孵育的人原代神经元和SH-SY5Y细胞凋亡[4]。Bcl-2在AD中的抗凋亡作用已经明确[5]。本研究利用Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞建立AD神经元损伤模型，研究旨在探讨LINC00612对神经元凋亡的调节作用及机制，为AD进展提供新的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 SH-SY5Y细胞来自上海吉凯基因化学技术有限公司细胞库。细胞在含有10%胎牛血清的DMEM/F12(Gibco，美国)培养液中于37 ℃，5% CO2环境中培养。

1.2 细胞转染 将SH-SY5Y细胞接种于96孔板，在37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h后根据Lipo3000转染试剂说明书进行转染。LINC00612过表达质粒于上海吉玛公司合成。

1.3 qRT-PCR 按照说明书使用PCR一步法试剂盒(Takara Bio，日本)进行实验。

LINC00612引物序列：

Forward：GGATCTCATCACCAGGCAAGCAC

Reverse：GTGACACTCCAAATCCCAGGAAGC

1.4 细胞活性检测 将SH-SY5Y细胞接种到96孔板，24 h后，分别用0，1，2，4，8，16 μmol/L Aβ1-42于37 ℃，5% CO2环境中孵育24 h。随后应用CCK-8试剂盒(碧云天，中国)进行细胞活力检测。

1.5 Western blot 收集细胞并超声裂解，BCA法测量蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，随后转印到PVDF膜上。PVDF膜用牛奶封闭2 h后，Bcl-2一抗(1：1000)，GAPDH(1：1000)孵育过夜。二抗室温孵育2 h后发光，分析灰度值。

1.6 细胞凋亡实验 使用Annexin V-FITC /PI(碧云天，中国)试剂盒进行染色。收集待测细胞，加入Annexin V-FITC，室温暗处温育染色15 min，随后加入PI染色5 min。应用流式细胞仪检测凋亡率。

1.7 RNA-pulldown实验 使用RNA-pulldown试剂盒(碧云天，中国)进行实验，应用western blot实验检测实验结果。

1.8 RIP实验 使用RIP试剂盒(碧云天，中国)进行实验，收集细胞裂解液，在含有磁珠和抗人anti-Ago2抗体的RIP缓冲液孵育，阴性对照组采用IgG孵育。纯化后的RNA应用qRT-PCR实验检测实验结果。

2 结 果

2.1 Aβ1-42孵育降低SH-SY5Y细胞活力 在37℃，5% CO2环境中，分别用0，1，2，4，8，16 μmol/L Aβ1-42孵育SH-SY5Y细胞24 h。CCK-8实验结果显示，8，16 μmol/L浓度的Aβ1-42显著降低SH-SY5Y细胞活力(见图1)。

图1 不同浓度的Aβ1-42对SH-SY5Y细胞活力的影响(*P<0.05 vs. Control)

2.2 LINC00612在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞中低表达 qRT-PCR结果表明，与Control组相比，LINC00612在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞中表达量显著降低(见图2)。

图2 LINC00612在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞中的表达(**P<0.01 vs. Control)

2.3 在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞中，过表达LINC00612增加Bcl-2的表达，抑制细胞凋亡 Western blot实验结果显示，在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞中，过表达LINC00612显著增加Bcl-2表达。细胞凋亡实验结果显示，过表达LINC00612显著抑制细胞凋亡(见图3)”。

图3 过表达LINC00612对Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞中Bcl-2(A)和凋亡(B)的影响(**P<0.01 vs. LINC00612(+)-NC)

2.4 LINC00612与Bcl-2结合，抑制Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞凋亡 RNA-pulldown实验结果显示，Bcl-2能够与LINC00612结合。RIP实验结果显示，anti-Bcl-2组LINC00612的富集程度显著高于anti-IgG组，提示Bcl-2能够靶向结合LINC00612(见图4)。

图4 在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞中，RIP(A)和RNA-pulldown(B)实验检测LINC00612与Bcl-2的结合作用(**P<0.01 vs. anti-IgG)

3 讨 论

本研究证明了在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞中，LINC00612表达显著上调；过表达LINC00612通过靶向结合Bcl-2，增加Bcl-2表达，抑制细胞凋亡。

一些研究表明，AD的发生发展与LncRNA表达异常紧密相关[6]。在AD大鼠模型中，MEG3通过抑制PI3K/Akt信号通路改善认知障碍，抑制海马神经元凋亡[7]。LncRNA RPPH1通过miR-326/PKM2轴降低Aβ25-35孵育SH-SY5Y细胞的凋亡[8]。本研究结果表明，过表达LINC00612能够抑制Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞凋亡。与本研究结果相似的研究结果有，在慢性阻塞性肺疾病中，过表达LINC00612能够下调Notch1，抑制人肺微血管内皮细胞凋亡[9]。

Bcl-2蛋白家族最初在B细胞淋巴瘤中发现，包括促凋亡因子(Bax，Bad)和抗凋亡因子(Bcl-2)[10]。抗凋亡因子Bcl-2在大脑中广泛表达，并与脑缺血，癫痫等疾病中的神经元损伤相关[11，12]。研究表明，由钙离子超载引起的兴奋性毒性损伤促进帕金森、AD等神经退行性疾病的发生发展[13～15]。在AD中，Aβ能够诱导氧化应激反应，升高细胞内钙离子浓度，促进细胞凋亡[16]。而Bcl-2能够减轻细胞内钙超载，保护神经元免受兴奋性毒性的伤害，抑制细胞凋亡[17]。本研究证明了LINC00612能够靶向结合于Bcl-2，上调Bcl-2的表达，降低Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞凋亡。

综上所述，本研究证明了LINC00612在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞中低表达，过表达LINC00612通过靶向结合Bcl-2下调其表达，抑制Aβ1-42孵育的神经元凋亡。本研究的结果为AD进展提供了新的实验依据，LINC00612下调Bcl-2的机制有待进一步研究。