环氧合酶2抑制剂NS-398对人肝癌细胞SMMC-7721增殖与凋亡的影响

方艳秋，齐亚灵，芦小单，马寅芙，谭 岩

（1.吉林省人民医院肿瘤生物治疗中心，吉林 长春 130021；2.佳木斯大学基础医学院组织胚胎学教研室，黑龙江 佳木斯 154007）

环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）是花生四烯酸AA合成前列腺素过程的重要限速酶，COX-2将AA代谢成各种前列腺素产物，参与维持机体的各种生理和病理过程[1]。COX-2抑制剂通过多种机制发挥抗肿瘤作用，其可能机制包括：抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、影响细胞周期进程和抗新生血管形成等[2]。目前COX-2抑制剂也被应用于肝细胞癌的治疗，但其抑制肝癌细胞的具体机制尚不清楚。本研究在以往研究的基础上，以肝癌细胞SMMC-7721为研究对象，分析COX-2抑制剂NS-398对肿瘤细胞形态、细胞周期、增殖和凋亡等的影响，进一步探讨COX-2抑制剂的抗肿瘤作用机制和应用前景。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 SMMC-7721肝癌细胞由本室传代培养；IMDM培养基、NS-398、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚枫（DMSO）和胰蛋白酶购自美国Sigma公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自美国Biovision公司；FACSCalibur型流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 细胞培养及主要试剂配制 人肝癌SMMC－7721细胞在37℃、5%CO2和95%空气饱和湿度培养箱中，用含10%胎牛血清的IMDM培养液常规培养。NS-398（用DMSO配制，使用时培养液中DMSO百分浓度不超过0.1%）终浓度为10g·L－1，4℃保存。MTT终浓度为5g·L－1。4℃避光保存，可用2周。

1.3 细胞分组及给药 将对数生长期的SMMC-7721细胞常规消化，制成单细胞悬液并计数，分别接种于96孔培养板和35mm培养瓶中，孵育24h，待细胞贴壁后将NS-398加入培养液中。细胞分 为 正 常 对 照 组 和 25、50、75、100、150μmol·L－1NS-398 组，每 组 选 取 作 用 24、48和72h3个时间点进行检测。

1.4 细胞悬液制备 在NS-398作用的不同时间点（24、48、72h），应用胰蛋白酶消化并收取培养的SMMC-7721细胞（由于受药物的影响，一些细胞脱落至培养液中，所以要同时收集贴壁生长的细胞和培养液中的细胞），1 000r·min－1离心5min，洗涤2次，70%冷乙醇固定，4℃保存。

1.5 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率 采用流式细胞术和Annexin V-FITC/PI双染色法进行检测，按照说明书操作。收集1×106个细胞，500～1 000r·min－1离心5min，加入500μL 1×Binding Bufer，1 000r·min－1离心5min，加入5μL V-FITC和5μL PI，室温避光孵育15min。上机检测前以500目筛网过滤。以0.1%Triton X-100作用1h作为细胞坏死的阳性对照，以0.01mmol·L－1地塞米松作用3h作为细胞凋亡的阳性对照。

1.6 细胞坏死和凋亡结果判断 凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料（如PI）有拒染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而无红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为FITC－/PI－）；右上象限显示非活细胞，即坏死细胞，为FITC＋/PI＋；而右下象限显示凋亡细胞，显现FITC＋/PI－。细胞凋亡指数（AI）＝（亚二倍峰细胞数/总细胞数）×100%。

1.7 MTT法检测细胞生长抑制率 取对数生长期SMMC-7721细胞，常规胰酶消化，制成单细胞悬液并计数，以每孔1×104个细胞共200μL接种于96孔培养板中，37℃、5%CO2培养12～24h，待细胞完全贴壁生长后，换液并加入不同浓度的NS-398，设无NS-398作用组作为空白对照（加入等量溶剂）。分别孵育24、48和72h后，每孔加入20μL MTT孵育4h后以DMSO每孔150μL终止反应。将96孔板移入平板震荡器，水平震荡10min。用酶联免疫检测仪于490nm波长处测定吸光度（A）值，以空白对照孔A值调零，记录结果。细胞生长抑制率 ＝（1－ 实验组A值/对照组A值）×100%。

1.8 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。细胞凋亡率和细胞生长抑制率以（±s）%表示， 组 间 差 异 比 较 采 用 Oneway ANOVA分析。

2 结 果

2.1 各组SMMC-7721细胞形态学 SMMC-7721

细胞生长较快，72h传代1次，倒置显微镜下可见正常生长的细胞呈单层、多边形贴壁生长，细胞轮廓较清晰。NS-398作用24h后，25μmol·L－1NS-398组培养瓶中细胞生长与正常对照组无明显差别；50与75μmol·L－1NS-398组细胞中增殖较慢，细胞数量少；100μmol·L－1NS-398组培养瓶中细胞增殖不明显，少量细胞变圆呈球型、较亮；150μmol·L－1NS-398组培养瓶中细胞生长被抑制，球形细胞增多。NS-398作用48h后，

25μmol·L－1NS-398组培养瓶中少量细胞变圆呈球型、较亮；100μmol·L－1NS-398组培养瓶中较多细胞变圆呈球型、较亮，贴壁生长细胞较少；150μmol·L－1NS-398组培养瓶中可见细胞悬浮，培养液变浑浊。NS-398作用72h后，100和150μmol·L－1NS-398组培养瓶中贴壁生长细胞很少，部分漂浮于培养液中，培养液浑浊。。

2.2 各组细胞周期及凋亡率 NS-398作用后能够引起SMMC-7721细胞周期发生改变，与正常对照组比较，其他各组细胞G0/G1期比例明显降低，G2/M期比例有升高趋势，这种改变具有明显的时间和浓度依赖关系（图1，见插页四）。正常对照组SMMC-7721细胞无凋亡峰，50μmol·L－1NS-398组SMMC-7721细胞作用24h后可见凋亡峰出现，作用48h后可见明显的亚二倍体峰，作用72h后凋亡峰更为明显（图2和3）。根据作用浓度和时间的不同，SMMC-7721细胞的凋亡率为3.53%～25.22%，且 呈 浓 度 和 时 间 依 赖 性。见表1。

图2 流式细胞术检测作用24h后各组SMMC-7721细胞的细胞周期点状图Fig.2 Scatter gram of cell cycle of SMMC-7721cells 24hafter treatment in various groups detected by FCM

图3 流式细胞术检测作用72h后各组SMMC-7721细胞的细胞周期点状图Fig.3 Scatter gram of cell cycle of SMMC-7721cells 72hafter treatment in various groups detected by FCM

2.3 各组SMMC-7721细胞生长抑制率 采用MTT法测定细胞的生长抑制情况。其抑制剂作用72h 后，25、50、75、100 和 150μmol·L－1NS-398组细胞生长抑制率分别为 10.51% ±2.21%、17.62% ±3.84%、39.81% ±3.48%、45.38%±4.52%和53.38%±4.34%，表明细胞生长活力随药物浓度的增加而降低，呈浓度依赖性。作用24、48和72h后25μmol·L－1NS-398组SMMC-7721细胞的生长抑制率分别为3.59%±1.32%、7.46%±1.05%和10.51%±2.21%，细胞生长抑制率随作用时间的延长而增加，呈时间依赖性。见图4。

表1 各组SMMC-7721细胞凋亡率Tab.1 Apoptotic rates of SMMC-7721cells in various groups [η/（±s）%]

表1 各组SMMC-7721细胞凋亡率Tab.1 Apoptotic rates of SMMC-7721cells in various groups [η/（±s）%]

Group Apop 18 25μmol·L－1 NS-398 5.07±0.32 10.33±0.43 13.93±0.23 50μmol·L－1 NS-398 7.81±0.65 11.86±0.45 17.48±0.28 75μmol·L－1 NS-398 8.12±0.83 12.46±0.22 18.53±0.76 100μmol·L－1 NS-398 9.24±0.45 13.55±0.41 20.14±0.66 150μmol·L－1 NS-398 24 48 72 Normaol control 3.53±0.21 3.94±0.25 3.66±0.totic rate（t/h）11.51±0.59 17.58±0.72 25.22±0.89

图4 不同时间各组SMMC-7721细胞的生长抑制率Fig.4 Inhibitory rates of proliferation of SMMC-7721cells in various groups at different time

3 讨 论

肝癌是死亡率较高的常见恶性肿瘤之一，严重威胁人类生命健康，全球每年新诊断的肝癌超过60万例，2011年已经达到74.9万例/年；其中，我国每年死于肝癌者约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45%。医学在飞速发展，但整体而言对肝癌的关注还是不多，现有的治疗方法有效率也较低。

COX-2抑制剂是非甾体类抗炎药（NSAIDs），可选择性地抑制COX-2，但对COX-1无抑制作用。COX-2抑制剂能够避免长期应用非选择性NSAIDs引起的血小板功能障碍、肾损害和消化道不良反应等副作用[3－4]。除此 之外，COX-2 抑制剂 NS-398能够在大鼠体内逆转高血压[5]。NS-398是选择性COX-2抑制剂，是一种磺胺类制剂的衍生物，可以通过多方面、多途径发挥抗肿瘤作用。有研究[6]证实：NS-398可以抑制人结肠癌细胞株的生长并可诱导癌细胞凋亡，但具体机制目前尚不十分明确。

本研究观察了COX-2抑制剂NS-398作用后人肝癌细胞SMMC-7721的生长状况，通过细胞数量和形态学变化初步判断了NS-398对SMMC-7721细胞的生长抑制作用，在作用24h后，25μmol·L－1NS-398组细胞生长抑制率为3.59%±1.32%，作用72h150μmol·L－1NS-398组细胞生长抑制率 为53.38%±4.34%，这一结果表明NS-398能够明显抑制SMMC-7721细胞的生长，其抑制作用与药物浓度和药物作用时间呈正比。与正常对照组比较，SMMC-7721细胞经不同浓度NS-398作用一定时间后，G0/G1期细胞比例明显下降，G2/M期比例呈上升趋势，说明NS-398的作用使SMMC-7721细胞聚集在G2/M期，因此推测NS-398对SMMC-7721细胞生长的抑制是通过对G2/M期阻滞实现的，并且这种抑制作用表现出良好的时间和浓度依赖性。Toyoshima等[7]在用选择性COX-2抑制剂对鳞状细胞癌细胞系影响（NA）的研究中发现：NS-398诱导COX-2高表达的NA的周期阻滞在G0/G1期，同时伴随周期素依赖性激酶抑制剂p21的上调。可见NS-398可能是通过改变细胞周期进程来抑制肿瘤细胞增生，而细胞周期阻滞也可能引发了细胞凋亡进程，具体机制还有待进一步研究。

肿瘤的发生是多途径、多步骤的，还与细胞凋亡有关，细胞增殖与凋亡之间的平衡失调与肿瘤的发生发展密切相关[8－11]。诱导细胞凋亡的因素很多，内部因素主要受体内某些基因调控，如Bcl-2、caspase和IAP是3个关系比较密切的家族；外界因素有γ射线、缺氧和抗肿瘤药物等。流式细胞术检测细胞凋亡水平具有直观、准确等优势[12－14]。本研究结果显示：NS-398能够引起SMMC-7721细胞发生凋亡，根据作用浓度和时间的不同，SMMC-7721细胞的凋亡范围为3.53%～25.22%，且呈浓度和时间依赖性。而正常生长的SMMC－7721细胞无凋亡峰，50μmol·L－1NS-398组SMMC-7721细胞作用24h后可见凋亡峰出现，作用48h后可见明显的亚二倍体峰，作用72h后凋亡峰更为明显。Kern等[15]对表达COX-2的4种肝癌细胞的研究发现：COX-2抑制剂的凋亡诱导作用与Bcl-2、BAX、AKT/PKB和BAD的磷酸化状态无关联，但与caspase-9、caspase-3及caspase-6的激活有关。还有学者[16－18]研究发现：NS-398能够引起非小细胞肺癌细胞的凋亡。本研究结果显示：选择性COX-2抑制剂NS-398可通过抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖、诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。COX-2抑制剂在抗肿瘤领域具有较好的应用前景。

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