顺铂对胶质瘤神经球的凋亡诱导作用及其机制

齐 玲，温 娜，杨淑艳，赵东海，王玮瑶，韩 磊，金 宏

（1.吉林医药学院病理学教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林医药学院实验中心，吉林 吉林 132013）

脑肿瘤以恶性胶质瘤最为多见，一经发现即处于晚期，预后极差。近年来研究[1－3]表明：脑肿瘤干细胞（brain tumor stem cells，BTSCs）是恶性胶质瘤发生和耐药的根源，但仍缺乏有效的治疗脑肿瘤的药物。顺铂是最常用的化疗药物之一，顺铂可以诱导多种肿瘤细胞发生凋亡[4]。但关于顺铂对BTSCs的作用及其机制尚未见报道。本课题组培养SHG-44胶质瘤神经球，对顺铂诱导神经球凋亡的作用及其机制进行研究。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 人脑胶质瘤SHG－44细胞株由吉林大学第一医院神经外科提供；顺铂和MTT购自美国Sigma公司，RPMI-1640购自美国Hyclone公司，神经培养基、小牛血清和B27添加物购自美国Gibco公司，人碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和人表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）购自英国PeproTech公司，Bax、Bcl-2和caspase-3抗体均购自北京中杉公司；CO2培养箱（CB150德国Binder公司），全自动酶标仪（PLUS384美国MDC公司），超低温冰箱（MDFU53V日本三洋公司），倒置显微镜（日本Nikon公司）。

1.2 神经球培养 自液氮罐中取出人脑胶质瘤SHG-44细胞接种于含10%小牛血清的 RPMI－1640培养液中，在37℃、5%CO2和饱和湿度条件下进行培养，隔日换液。待细胞生长至80%～90%，将SHG-44细胞以1×104cm－2的密度接种至75cm2培养瓶，加入干细胞培养液（stem cells media，SCM），包括神经培养基、B27添加物、20μg·L－1EGF和bFGF。继续培养，每3～5d换液1次，传代时机械吹打使神经球成单细胞悬液，按1∶2比例传代，3代以后的神经球用于实验。

1.3 MTT法检测SHG-44神经球生长抑制率取对数生长期的SHG-44神经球，调整细胞浓度为5×105mL－1，以每孔100μL细胞悬液接种于96孔板中，置入37℃、5%CO2培养箱中培养。实验设为对照组和顺铂组，每组5个复孔，对照组只加SCM，顺铂组加入含10mg·L－1顺铂的SCM，分别作用24、48和72h后弃上清，每孔加入MTT 20μL继续孵育4h，弃上清后每孔加DMSO 150μL，震荡15min使结晶充分溶解，在自动酶标仪570nm波长处测定各孔吸光度（A）值，计算细胞生长抑制率：生长抑制率＝（对照组A值－实验组A值）/对照组A值×100%。

1.4 ELISA法测定神经球培养上清中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白分泌水平 将SHG-44神经球以1×105mL－1密度接种于24孔培养板中，实验分为对照组（不含药物）和顺铂组（10mg·L－1），作用72h，每组设5个复孔。取细胞培养上清，将上清液与包被液按1∶1比例包被后4℃过液。封闭后加入 Bax、Bcl-2和caspase-3抗体（1∶500稀释）于4℃过夜。加入二抗（1∶1 000稀释）室温下孵育2h，DAB显色液室温避光显色。于自动酶标仪492nm处测定A值，计算Bax/Bcl-2比值。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。各组神经球生长抑制率以（±s）%表示，Bcl-2、Bax 和 caspase-3 蛋 白 分 泌 水 平 以±s表示，组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1 各组神经球生长抑制率 10mg·L－1顺铂作用SHG-44神经球24、48和72h，均能明显地抑制神经球细胞的生长。与对照组比较，24、48和72h时顺铂组神经球的生长均受抑制，生长抑制率差异均有统计学意义（P＜0.01），以72h时顺铂组神经球的生长受抑制最为明显。见表1。

表1 各组SHG-44神经球的生长抑制率Tab.1 Inhibitory rates of SHG-44neuroshperes in various groups [η/（±s）%]

表1 各组SHG-44神经球的生长抑制率Tab.1 Inhibitory rates of SHG-44neuroshperes in various groups [η/（±s）%]

＊ P＜0.01compared with control group.

Group Inhibitoryrate（t/h）24 48 72 Control 0.00±0.02 0.00±0.01 0.00±0.02 Cisplatin 15.51±2.82＊ 11.36±3.80＊ 21.38±3.66＊

2.2 神经球凋亡形态学 倒置显微镜下观察，在10mg·L－1顺铂作用24、48和72h时神经球数量减少，每个时间段神经球均可见明显的凋亡小体，并随着时间的延长，SHG-44神经球凋亡的细胞越来越多，尤其以72h时最为明显。见图1。

2.3 神经球分泌 Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白水平 10mg·L－1顺铂作用SHG-44神经球72h后，神经球分泌Bax和Bcl-2水平均减少，但以Bcl－2减少尤其明显；与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。Bax/Bcl-2比值明显升高，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。顺铂组神经球caspase-3分泌量增多，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

图1 SHG-44神经球凋亡形态学（×200）Fig.1 Morphology of apoptosis of SHG-44neurospheres（×200）

表2 SHG-44神经球分泌 Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白水平Tab.2 Levels of Bax，Bcl-2，and caspase-3proteins secreted by SHG-44neuroshperes （±s）

表2 SHG-44神经球分泌 Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白水平Tab.2 Levels of Bax，Bcl-2，and caspase-3proteins secreted by SHG-44neuroshperes （±s）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with control group.

ase-3 Control 0.69±0.05 0.53±0.02 1.31±0.24 0.53±Group Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2 casp 0.02 Cisplatin 0.58±0.03 0.31±0.04＊ 1.86±0.21＊＊ 0.72±0.04＊

3 讨 论

近年来，恶性肿瘤发病率呈现逐年攀升的趋势，在脑肿瘤中以恶性胶质瘤的发病率升高最为明显[5]。这种高恶性的肿瘤给人们的生命健康带来了极大的威胁，给患者及其家庭带来了沉重的负担。研究[6－7]表明：包括胶质瘤在内的恶性脑肿瘤的生长和更新是由脑肿瘤中存在BTSCs所引起，大量的证据[6－7]证实：BTSCs是脑肿瘤发生、复发的根源，也使肿瘤对放化疗抵抗。因此，对脑肿瘤的研究开始集中到对BTSCs的研究方面。

神经球悬浮培养法是1992年由Reynolds和Weiss[9]建立起来的，最初用来分离神经干细胞，在神经球中的细胞仅有10%～50%的细胞具有干细胞特性，其他细胞会继续分化；在SCM中，干细胞、祖细胞和终末分化细胞形成了神经球，分化细胞会在传代时迅速死亡，干细胞则继续增殖再形成神经球，这个过程多次重复后培养体系中就存在大量、稳定的干细胞。之后这一方法也用于BTSCs的研究中[10－11]。本课题组采用该方法培养出具有BTSCs特性的神经球[12]，研究常用化疗药物顺铂对神经球凋亡的诱导作用及其机制。

本研究结果显示：10mg·L－1顺铂作用SHG-44神经球24、48和72h时能明显地抑制神经球的生长，各时间段对神经球的生长抑制率均高于对照组；顺铂作用72h时，神经球的生长抑制率升高最为明显。10mg·L－1顺铂作用SHG-44神经球24、48和72h时，倒置显微镜下见到神经球数量明显减少，各组均可见到明显的凋亡小体，并随着时间的延长，凋亡细胞逐渐增多，以72h最为明显。说明10mg·L－1顺铂在不同时间时均可以抑制神经球的生长，镜下观察显示：神经球生长受抑制是由于顺铂诱导神经球发生凋亡，引起神经球数量减少所致。

可以通过多种方式诱导凋亡发生，但线粒体信号转导路径在凋亡的发生中始终起到非常重要的作用。线粒体凋亡路径中的Bcl-2家族成员一直处于凋亡研究的热点[13]，研究[14－15]表明：在线粒体上，Bcl-2等抗凋亡蛋白阻断了Bax等的促凋亡作用，当Bcl-2表达水平减少就会降低这种阻遏作用，使Bax等激活进而克服抗凋亡蛋白Bcl-2的作用，改变线粒体膜的生物学特性，促使某些线粒体蛋白的释放[12]，引起凋亡发生。在本研究中，10mg·L－1顺铂作用SHG-44神经球72h后，顺铂组Bax/Bcl-2比值明显高于对照组。说明Bax/Bcl-2比值升高使促凋亡因素占据优势，因而促使神经球凋亡发生。但具体凋亡的机制还有待进一步研究。

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