抗抑郁药奥氮平对大鼠海马神经细胞凋亡和细胞周期的影响

刘 颖，张 萱，刘纯岩，倪文杰，毛洪涛，王珍琦

（1.吉林大学公共卫生学院 卫生部放射生物学重点实验室，吉林 长春 130021；2.吉林省妇幼保健院中心实验室，

吉林 长春 130061；3.吉林大学第二医院科教科，吉林 长春130041；4.吉林大学第二医院放射线科，吉林 长春 130041）

神疾病严重影响中枢神经系统功能，降低生活质量。仅美国就有近四分之一的成年人被诊断为患有精神疾病，如抑郁症、焦虑症和精神分裂症。理解这些精神疾病的神经生物学基础、减轻症状和制定有效的治疗手段是当今精神病学发展的方向。抑郁症是最普遍的精神疾病，在世界范围内发病率很高。尽管进行了大量的研究工作，但抑郁症潜在的病理生理机制仍未完全清楚。海马是脑内在记忆、认知和情绪调节方面起非常重要作用的区域。抑郁症伴有海马容积的减少及海马功能缺欠，这很可能与抑郁症的发病密切联系。此外，研究者[1－3]也进行了许多抑郁对海马容积影响的研究，发现早期抑郁已经伴有海马容积的改变，抑郁症患者海马灰质的减少，可以通过抗抑郁药的治疗而得到改善[3]。有研究表明：一些抗抑郁药的确能增加抑郁症患者的齿状回细胞增殖，提示其可能具有神经保护作用，但机制尚未清楚。本研究采用体外原代培养的SD大鼠海马神经元，复制谷氨酸（glutamate，Glu）损伤模型，模拟抑郁症时大鼠海马的病理改变，体外研究抗抑郁药奥氮平对大鼠海马神经细胞凋亡和细胞周期的影响，从凋亡和细胞周期的角度，进一步探讨奥氮平的作用机制。目前，国内外尚无此方面的报道。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器 在吉林大学实验动物中心购买即将分娩的怀孕Wistar大鼠10只，体质量约300g，取出生1d的胎鼠用于实验；高糖和低糖DMEM培养基购自美国Gibco公司，马血清为Hyclone公司产品，胎牛血清为北京圣马生物制品研究所产品，多聚赖氨酸、胰酶、碘化丙啶（PI）和Hochest33258（Ho）购自美国Sigma公司，Glu为上海化工试剂研究所产品，奥氮平由加拿大萨斯喀切恩大学李新民教授惠赠，其余试剂为市售分析纯；流式细胞仪为美国ABI公司产品。

1.2 原代神经元培养 取出生1d的 Wistar大鼠，经75%的酒精消毒，无菌条件下开颅取海马；置于冷的无Ca2＋、Mg2＋的D-Hank’s液中，剪碎成0.5mm×0.5mm×0.5mm 的小块；置于 DHank’s管中静止5min后，弃去上清，加入0.25%胰蛋白酶2mL，于37℃消化15～20min，加入5mL培养液（高糖DMEM、10%胎牛血清、10%马血清）终止消化；Paster滴管吹打，离心（1 500r·min－1、5min）2次，调整细胞浓度为2×106mL－1。将细胞悬液加入事先用聚L-lysine处理过的培养皿或培养板中。置于CO2恒温培养箱中于37℃、5%CO2条件下培养。第2天全部换液，以后每3d换半液。

1.3 Glu损伤模型的复制 参照文献[4]，稍加改进。神经元培养至2周时，细胞成熟可用于实验。在应用Glu前6～12h，将海马神经细胞的培养液换成无血清的培养液，去除外源性神经营养因子。实验时吸去培养液，以Tris缓冲液（25mmol·L－1Tris-HCl、120mmol·L－1NaCl、1.8mmol·L－1CaCl2、5.4mmol·L－1KCl和 15mmol·L－1Glucose，调pH值为7.4）洗2次，加入终浓度为500μmol·L－1Glu，将奥氮平加入低糖、无血清培养基中，而后加入培养板中，空白培养液补足体积。置于37℃、5%CO2培养箱培养。模型复制完成后，采用MTT法检测神经元存活率以判定模型复制是否成功。

1.4 细胞分组及处理 培养2周的海马神经元随机分为正常对照组（吸除原有培养基，单纯更换低糖DMEM培养基）、Glu损伤组（吸除原有培养基，换成终浓度为500μmol·L－1Glu的低糖DMEM培养基）、奥氮平 ＋Glu损伤组 [吸除原有培养基，分别加入不同浓度（0.1、1.0、10.0、50.0、100.0、200.0和500.0μmol·L－1）奥氮平，且Glu终浓度为500μmol·L－1的无血清、低糖DMEM培养基]。在培养箱中继续培养48h，而后分别测定各组神经元凋亡率、坏死率和细胞周期的改变。

1.5 检测细胞凋亡率和细胞周期的变化 收集细胞，用8mL PBS离心1 500r·min－1×5min×3次，加入1mL PBS重悬细胞，用4mL冷乙醇固定，置－20℃冰箱过夜，离心（1300r·min－1、5min），洗 去 固 定 液，加 入 PBS 离 心（1 300r·min－1、5min），弃上清。而后，每份样品加入RNaseA 100μL（100mg·L－1），37℃孵 育 30min，加 PI（含 0.1%Triton X-100）300μL（50mg·L－1），4℃避光负染30min，采用流式细胞术检测，CellQuest软件收集1×104个细胞，采用ModFit LT软件分析细胞凋亡率和细胞周期的变化。细胞凋亡率（%）＝（凋亡细胞/细胞总数）×100%。

1.6 Ho和PI双染检测神经元坏死率 用0.1%Triton X-100作用1h作为细胞坏死的阳性对照，每份样品中加Hochest 33258 150μL（100mg·L－1），PI 100μL（0.05g·L－1），37℃温育30min后，采用流式细胞仪收集1×104个细胞，CellQuest软件分析结果，计算细胞坏死率。细胞坏死率（%）＝（坏死细胞/细胞总数）×100%。

1.7 统计学分析 采用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析。神经元凋亡率和坏死率以（±s）%表示，组间比较采用χ2检验。

2 结 果

2.1 各组神经元凋亡率 与正常对照组比较，Glu损伤组和奥氮平＋Glu损伤组细胞凋亡率增加（P＜0.05或P＜0.01）；与 Glu损伤组比较，10.0μmol·L－1奥氮平＋Glu损伤组细胞凋亡率下降（P＜0.01）。见表1和图1（插页一）。

2.2 各组神经元坏死率 与正常对照组比较，Glu损伤组神经元坏死率升高2.9倍（P＜0.05）；与Glu损伤组比较，奥氮平＋Glu损伤组细胞坏死比率降低。100.0和200.0μmol·L－1奥氮平＋Glu损伤组坏死降低最为显著（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

2.3 各组神经元细胞周期 与正常对照组比较，Glu损伤组神经细胞周期各时相细胞的百分数发生变化，G0/G1期细胞百分数增加（P＜0.01），S期细胞百分数下降（P＜0.01），G2＋M期变化不明显。而与 Glu损伤组比较，50.0、100.0和200.0μmol·L－1奥氮平＋Glu损伤组神经细胞周期进程发生显著变化，G0/G1期细胞百分数下降，S期和 G2＋M 期细胞百分数上升。50.0和100.0μmol·L－1奥氮平＋Glu损伤组G0/G1期细胞百分数分别下降为Glu损伤组的79.9%和62.6%（P＜0.05或P＜0.01），S期细胞百分数分别为Glu损伤组的2.5和3.8倍（P＜0.05或P＜0.01）。见表2。

表1 各组神经元凋亡率和坏死率Tab.1 Apoptotic rates and death rates of neurons in various groups [η/（±s）%]

表1 各组神经元凋亡率和坏死率Tab.1 Apoptotic rates and death rates of neurons in various groups [η/（±s）%]

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs Glu injury group；“—”：Not detected.

Group Apoptotic rate Death rate 1.4±0.4 15.3±0.6 Glu injury 4.3±0.5＊＊ 44.0±4.6＊0.1μmol·L－1 olanzapina＋Glu injury — 38.4±8.3 1.0μmol·L－1 olanzapina＋Glu injury — 29.7±2.2 10.0μmol·L－1 olanzapina＋Glu injury 1.8±0.3＊△△ 25.2±4.9 50.0μmol·L－1 olanzapina＋Glu injury 2.2±1.4＊ 25.1±3.2 100.0μmol·L－1 olanzapina＋Glu injury 3.5±2.4＊ 24.4±5.0△△200.0μmol·L－1 olanzapina＋Glu injury 2.1±0.9＊ 24.1±11.0△500.0μmol·L－1 olanzapina＋Glu injury —Normal control 38.9±0.6

3 讨 论

本文作者近年在抗抑郁药的神经保护作用方面进行大量研究[5－10]发现：抗抑郁药万拉法新和奥氮平在体外实验中均都能抵抗Glu诱导的神经元损伤，维护细胞膜的完整性，减少乳酸脱氢酶的漏出，增加超氧化物酶活性，提高神经元存活率，使存活细胞数量增加，证实二者可能均具有神经保护作用[5－7]。但其作用机制尚需进一步阐明。因此，本文作者又采用体外原代培养的Wistar大鼠海马神经元，复制Glu损伤模型，模拟抑郁症时的病理改变，在体外研究抗抑郁药万拉法新和奥氮平对大鼠海马神经细胞凋亡和细胞周期的影响。

表2 各组神经元细胞周期Tab.2 Cell cycles in various groups [η/（±s）%]

表2 各组神经元细胞周期Tab.2 Cell cycles in various groups [η/（±s）%]

＊ P＜0.05，and＊＊ P＜0.01 vs Glu injury group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs normal control group.

Group G0/G1 S G2＋M 72.5±0.2 25.3±0.6 2.1±0.9 Glu injury 88.2±0.5△△ 11.5±0.5△△ 0.3±0.0 10.0μmol·L－1 Olanzapine＋ Glu injury 91.1±4.1 7.9±5.2 1.0±1.1 50.0μmol·L－1 Olanzapine＋ Glu injury 70.5±3.9＊ 28.8±4.3＊ 0.7±0.6 100.0μmol·L－1 Olanzapine＋ Glu injury 55.2±0.5＊＊△ 43.8±1.6＊＊△ 1.0±1.2 200.0μmol·L－1 Olanzapine＋ Glu injury Normal control 82.1±11.9 17.5±12.2 0.4±0.3

本研究结果显示：高浓度Glu影响体外培养大鼠海马神经元细胞的存活，使凋亡和坏死均明显增加，且以坏死为主；而奥氮平能明显抵抗Glu诱导的神经元损伤，使凋亡率和坏死率均明显下降，且最佳浓度为10～200μmol·L－1。结合以往研究[10－11]结果发现：万拉法新和奥氮平具有共同的作用趋势，均能减少Glu损伤引起的凋亡和坏死，二者比较，奥氮平的作用强于万拉法新。提示抵抗Glu损伤可能是二者共同的机制。在本研究中，与Glu损伤组比较，10.0～200.0μmol·L－1奥氮平＋Glu损伤组细胞凋亡率和坏死率均呈下降趋势，而在低于10.0μmol·L－1和高于200.0μmol·L－1奥氮平的浓度下，结果无明显变化，原因考虑是当奥氮平浓度低于10.0μmol·L－1时，药物未达到有效剂量，所以对于Glu引起的损伤未产生抵抗作用；而浓度高于200.0μmol·L－1时，由于奥氮平浓度过高，本身可能就会有一定的毒性作用，造成凋亡和坏死细胞比例无明显变化。本研究结果显示：Glu诱导的神经元损伤使G0/G1期细胞百分数增加，S期细胞百分数下降，表明Glu抑制神经元的DNA合成，减少了细胞的增殖；而奥氮平作用后，表现为G0/G1期细胞百分数不同程度减少，S期细胞增加，进入DNA合成期的细胞增加，促进细胞增殖。在以往的研究[9]中，万拉法新也表现出了同样的作用趋势，表明抗抑郁药促进神经生成的作用很可能是通过促进细胞增殖实现的。

综上所述，抗抑郁药奥氮平和万拉法新均具有神经保护作用，且均能促进S期细胞增加，抵抗Glu引起的细胞凋亡和坏死，这很可能涉及二者共同的作用机制，下一步研究应当从影响凋亡和细胞周期的基因表达入手，从分子水平进一步揭示其机制，为指导临床合理用药提供确凿的实验室依据。

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