RUNX3全长和不同结构域原核表达载体的构建及其重组蛋白表达

宋艳艳，王桂玲

（中国医科大学细胞生物学教研室 卫生部细胞生物学重点实验室，辽宁 沈阳 110001）

Runx3（Runt-related gene 3）是一种新型肿瘤抑制基因，最初是在1994年由Levanon等发现，先后被命名为急性髓性白血病2基因（AML2）、多瘤病毒强化因子结合蛋白2基因（PEBP2aC）和核心结合因子3基因（CBFA3）[1]。人类的RUNX3蛋白是RUNX家族长度最小的成员，其cDNA全长1 784bp，开放阅读框（ORF）为1 245bp，编码415个氨基酸。RUNX家族，除包含RUNX3/PEBP2αC外，还包括急性髓性白血病1（RUNX1/AML1）和核心结合因子 1（RUNX2/CBFA1），经鉴定该家族蛋白结构中均含有128个氨基酸组成的RD保守的序列，该区域被称为 Runt结构域[2－5]。该 Runt结构域位于RUNX蛋白的氨基末端，是多细胞家族中序列特异的DNA结合结构域[6]，该结构域与果蝇的成对控制（pair rule）基因Runt序列同源，在模式生物（如果蝇、线虫等）的研究[7]中发现：Runt结构域具有肿瘤抑制功能，所以与正常的机体发育和人类成因性的多种类癌症有关联。在RUNX家族蛋白中，RUNX3对肿瘤的的抑制作用最为显著，已经有相关实验[7]证实：其蛋白表达水平的变化与胃癌、结肠癌和膀胱癌等多种癌症有关联。而且RUNX3可通过Runt结构域激活或抑制转录过程。Goh等[3]从RUNX3的Runt结构域出发，研究RUNX3蛋白与Src激酶的相互作用，且取得一定进展。最新研究表明：RUNX3在胃癌中呈低表达，与淋巴结转移和不良预后有关联。但目前有关RUNX3的Runt结构域的功能研究还比较局限，相关的作用机制尚不十分明确，因此构建RUNX3全长和不同结构域的原核表达载体具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 菌株和主要试剂 大肠杆菌DH5α和BL21感 受 态 为 本 实 验 室 制 备；pcDNA3.1A-myc-RUNX3质粒为本实验室前期构建，质粒纯化试剂盒购自美国Qiagen公司，引物合成和DNA测序由金斯瑞公司完成，PyrobestTM DNA polymerase、dNTP、DNA电泳凝胶回收试剂盒和各种限制性核酸内切酶购自大连TaKaRa公司，DNA Marker、Protein Marker购自美国GenScript公司，T4DNA连接酶购自美国NEB公司。

1.2 引 物 设 计 与 合 成 以 pcDNA3.1-myc-RUNX3质粒为模板，设计RUNX3全长及不同截短区段引物，5′端引入BamHⅠ酶切位点，3′端引入EcoRⅠ酶切位点并插入终止子，采用PCR法扩增相应功能域片段。其中，Nter、Runt和Cter可利用常规PCR法合成，ΔRunt利用重叠PCR方法合成，先分别以Nter的上游引物和RUNX3－ΔRunt-R 合成特定的 Nter，以 RUNX3－ΔRunt-F和Cter的下游引物合成特定的Cter，再以该特定的Nter和Cter按1∶1混合为模板，由Nter的上游引物和Cter的下游引物合成ΔRunt。

1.3 RUNX3全长及不同结构域截短的原核表达载体的构建 采用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEX-4T-2空载体及经同样酶切处理的PCR产物，试剂盒回收酶切后的pGEX-4T-2空载体和PCR产物，用T4DNA连接酶连接16℃ 过夜，得到连接产物。取5μL上述连接反应液转化感受态细菌E.coliDH5α中，涂布于含氨苄西林的LB琼脂平板，37℃ 培养过夜。各挑取3～6个白色菌落，接种于氨苄西林3mL的LB培养液中，37℃震荡过夜。碱裂解法制备质粒DNA，采用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定重组质粒，并送金斯瑞公司测序，测序正确后，分别将构建的质粒命名 为 pEGX-4T-2-FL、pGEX-4T-2-Nter、pGEX-4T-2-Runt和pGEX-4T-2-Cter。

1.4 RUNX3全长及不同结构域的原核表达载体表 达 蛋 白 的 诱 导 将 质 粒 pEGX-4T-2-FL、pGEX-4T-2-Nter、pGEX-4T-2-Runt和 pGEX-4T-2-Cter导入大肠埃希菌BL21感受态中，涂布于含氨苄西林的LB琼脂平板，37℃ 培养过夜。各挑取白色菌落3～5个，碱裂解法制备质粒DNA，经BamHⅠ和EcoRⅠ 双酶切后鉴定阳性克隆。挑取转化后的单个菌落接种至含氨苄西林的LB培养基中 ，37℃ 培养过夜后，按菌液∶培养基＝1∶100稀释，37℃ 培养至 吸光度（A600）值为0.6左右时，加入摩尔浓度1.0mmol·L－1IPTG，分别诱导培养3、4和5h时，收集菌体，加入100μL 2×SDS Loading buffer中 ，100℃ 加热5min，12 000r·min－1离心5min，冰上放置，取上清行8%SDS-PAGE电泳。电泳结束后行考马斯亮蓝染色，脱色后观察电泳结果。根据电泳结果，选定最适合的诱导时间和IPTG浓度，再在该条件下，利用GST-Beads大量纯化以上蛋白，最后各取10μL样品，经10%SDS-PAGE电泳后行考马斯亮蓝染色，脱色后观察电泳结果。

2 结 果

2.1 RUNX3全长及不同结构域截短的结构特点

根据对RUNX3（NM＿004350.2）开放阅读框和前 期 实 验 结 果 确 定 RUNX3-FL，RUNX3-ΔRunt、RUNX3-Nter、RUNX3-Runt和 RUNX3－Cter的结构（图1），并根据该结构设计引物，经PCR获得各片段（图2），各片段长度分别为RUNX3-FL 1 245bp、RUNX3-ΔRunt 843bp、RUNX3-Nter 159bp、RUNX3-Runt 402bp 和RUNX3-Cter 684bp，与预期相符。

图1 RUNX3全长及不同结构域截短的结构模式图Fig.1 Schematic diagrams of overall length and different domain truncations of RUNX3

图2 RUNX3全长和不同结构域截短片段PCR电泳图Fig.2 PCR electrophoregram of overall length and different domain truncations of RUNX3

2.2 RUNX3全长和不同结构域片段重组质粒酶切鉴 定 将 构 建 好 的 质 粒 pEGX-4T-2-FL、pGEX-4T-2-Nter、pGEX-4T-2-Runt和 pGEX-4T-2-Cter，经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，得到与PCR结果相同长度的片段，与预期结果相符，并经测序鉴定正确。见图3。

2.3 SDS-PAGE电泳分析纯化后的 GST-RUNX3融合蛋白 将测序正确的质粒 pEGX-4T-2-FL、pGEX-4T-2-Nter、pGEX-4T-2-Runt和 pGEX-4T-2-Cter导入大肠杆菌BL21中，挑取单菌落诱导表达蛋白，利用 GST-Beads大量纯化以上蛋白，10%SDS-PAGE电泳后，可在相应的预期位置得到特异性的蛋白带，谷胱甘肽转移酶（GST）相对分子质量为26 000，可见RUNX3不同结构域（FL、Runt、Nter和Cter）的融合蛋白相对分子质量分别约为72 000、40 000、32 000和51 000。见图4。

图3 BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切RUNX3全长和不同结构域片段的电泳图Fig.3 Electrophoregram of overall length and different domain fragments of RUNX3digested by BamHⅠ/EcoRⅠ

图4 RUNX3全长和不同结构域片段的重组质粒融合蛋白SDS-PAGE电泳图Fig.4 SDS-PAGE electrophoregram of recombinant plasmid fusion protein of overall length and different domain fragments of RUNX3

3 讨 论

Runx3基因位于人类染色体1p36.1，全长约67 000，由P1和P2这2个启动子和6个外显子及1个1 245bp的DRF组成[9]。通过对胃癌临床病例的研究发现：RUNX3在这些胃癌组织中规律地表现杂合性缺失和启动子区域的高甲基化，表明其在胃癌发生发展中发挥重要作用，而且Runx3基因的灭活机制不同于其他肿瘤抑制基因（如P53）[4]，不是依赖突变，所以Runx3将是很好的药物作用的靶点，也许为未来胃癌的临床治疗提供一种思路。不仅如此，Runx3基因在其他肿瘤中均出现特异性的低表达，与多种肿瘤的标记分子存在一定联系，如在乳腺癌中与雌激素依赖受体（estrogen receptor，ER）α存在负相关关系，从而抑制乳腺癌细胞或乳腺癌组织的生长[10]。RUNX3作为肿瘤抑制因子，其失活机制常与启动子区的高甲基化有关联，在乳腺癌细胞中，双甲基化RUNX3的启动子区，可以促进细胞增殖和凋亡[11]。Runx基因参与正常组织的造血、骨形成和神经发育过程，在胃肠道和表皮发育过程中也起决定性作用。所以Runx基因结构及相关功能研究具有临床意义。

蛋白的功能研究需要高丰度的蛋白表达量，内源性的蛋白一方面在体内表达量低，另一方面不宜直接从其蛋白本身出发研究其功能，而基因工程的分子克隆过程解决了这一问题，通过人工构建的载体，实现蛋白的特异性高表达。本实验不仅实现了RUNX3的高表达，而且还将RUNX3蛋白的几个特征性的结构域构建为稳定表达的载体，从而为研究RUNX3在肿瘤形成中所扮演的角色奠定前期实验基础。现已有报道[12－13]证实：RUNX3的 Cter区域是RUNX3在核定位时所必须的，而RUNX3只有在细胞核定位时才会发挥肿瘤抑制功能，可见Cter对于研究RUNX3肿瘤抑制机制具有重要意义。而RUNX3的Runt区域是RUNX3与蛋白相互作用的主要结构域，可以通过体外GST Pull Down等方法验证RUNX3可以与哪些相关蛋白相互作用，从而进一步探究相互作用后会有哪些相关功能的改变。

本实验从RUNX3不同结构域出发，构建了不同结构域的原核表达载体，并在IPTG诱导下，利用GST-beads大量纯化各区域蛋白，经电泳证实了各重组蛋白的表达。本课题组借助原核表达载体实现融合蛋白表达的方法，既利于纯化，又利于保护蛋白的活性，从而为RUNX3蛋白的相关研究奠定了实验基础。

[1]Levanon D，Negreanu V，Bernstein Y，et al.AML1，AML2and AML3，the human members of the runt domain gene-family：cDNA structure，expression and chromosomal localization [J].Genomics，1994，23（2）：425-432.

[2]Bae SC， Lee YH. Phosphorylation， acetylation and ubiquitination：The molecular basis of RUNX regulation [J].Gene，2006，366（1）：58-66.

[3]Goh YM，Cinghu S， Hong ET， et al. Src kinase phosphorylates RUNX3at tyrosine residues and localizes the protein in the cytoplasm [J].J Biol Chem，2010，285（13）：10122-10129.

[4]Chi XZ，Kim J，Lee YH，et al.Runt-related transcription factor RUNX3is a target of MDM2-mediated ubiquitination [J].Cancer Res，2009，69（20）：8111-8119.

[5]Coffman JA.Is runx a linchpin for developmental signaling in metazoans？[J].J Cell Biochem，2009，107（2）：194-202.

[6]Walrad PB， Hang S， Joseph GS， et al. Distinct contributions of conserved modules to runt transcription factor activity [J].Mol Biol Cell，2010，21（13）：2315-2326.

[7]Alarcón-Riquelme ME. Role of RUNX in autoimmune diseases linking rheumatoidarthritis，psoriasis and lupus [J].Arthritis Res Ther，2004，6（4）：169-173.

[8]Cheng HC，Liu YP，Shan YS，et al.Loss of RUNX3 increases osteopontes expression and promotes cell migration in gastric cancer[J].Carcinogesis，2013，Jun 17 [Epub ahead of print].

[9]Bangsow C，Rubins N，Glusman G，et al.The RUNX3 gene-sequence，structure and regulated expression [J].Gene，2001，279（2）：221-232.

[10]Huang B，Qu Z，Ong CW，et al.RUNX3acts as a tumor suppressor in breast cancer by targeting estrogen receptorα [J].Oncogene，2012，31（4）：527-534.

[11]Kang HF，Dai ZJ，Bai HP，et al.RUNX3gene promoter demethylation by 5-Aza-CdR induces apoptosis in breast cancer MCF-7cell line [J].Onco Targets Ther，2013，6：411-417.

[12]Chuang LSH，Ito Y. RUNX3is multifunctional in carcinogenesis of multiple solid tumors [J].Oncogene，2010，29（18）：2605-2615.

[13]Voon DC，Wang H，Koo JK，et al.Runx3protects gastric epithelial cells against epithelial-mesenchymal transitioninduced cellular plasticity and tumorigenicity [J].Stem Cells，2012，30（10）：2088-2099.