mcr-1阳性类噬菌体质粒与F33∶A-∶B-质粒共整合形成的融合质粒的生物学特性分析

王亮亮,王倩倩,朱莹莹 ,庞子峰,朱玉喜,植婵萍,潘玉善,刘建华,贺丹丹*

(1.河南农业大学,河南 郑州 450000；2.广东茂名农林科技职业技术学院,广东 茂名 525000)

F33∶A-∶B-型质粒是多重耐药质粒IncF型质粒中最为流行的亚型之一,它广泛存在于肠杆菌科细菌,尤其是大肠杆菌中,是介导fosA3、blaCTX-Ms和rmtB等耐药基因快速传播的主要载体[1-3]。F33∶A-∶B-型质粒除了能够借助IS26和IS1294元件捕获和传播抗性基因外,还能够获得IncN1、IncI1、IncR和IncX1型质粒的一些片段成为多复制子质粒[3]。本课题组在研究猪源大肠杆菌中mcr-1的水平转移能力时,首次发现在接合过程中,F33∶A-∶B-型质粒pD72-F33捕获了大约96 kb的mcr-1阳性类噬菌体质粒pD72-mcr-1形成融合质粒pD72C；序列分析发现,其质粒融合机制是pD72-F33上1个拷贝的IS26攻击pD72-mcr-1上8 bp的目标位点(CAGCATTT)[4]。

质粒介导的粘菌素耐药基因mcr-1已经成为全球关注的重点。自2015年mcr-1被首次报道后,该基因在世界范围内不同来源的不同菌种中广泛出现[5-7]。不同的mcr-1阳性不相容群质粒不断被报道,尤其是较流行的IncI2、IncX4和 IncHI2型质粒,它们所具有的较高的稳定性和适应性优势对mcr-1的快速传播起到重要作用[8-10]。除了可接合性质粒,Tn6330 (ISApl1-mcr-1-ISApl1)与mcr-1的快速传播密切相关,Tn6330能够通过形成环形中间体形式促使mcr-1插入到其它细菌的染色体或质粒的TA富集区[11-14]。目前报道的mcr-1阳性类噬菌体质粒具有较高的核酸序列同源性,其中大多数不具有自身转移性,因此这类质粒对mcr-1的快速水平传播作用具有局限性[4]。本研究中的mcr-1阳性类噬菌体质粒pD72-mcr-1具有不可接合性,然而,可接合性F33∶A-∶B-型质粒与之融合后的共整合质粒具有可接合性,这暗示F33∶A-∶B-型质粒能够作为1个接合辅助质粒提供给不可接合质粒的接合转移能力,进而促使mcr-1的快速传播[4]。质粒融合使质粒进化成携带更多耐药基因的质粒,然而该融合质粒在受体菌中是否能够稳定存在？对受体菌是否产生适应性代价？对该融合质粒的融合频率和接合频率也不清楚。鉴于此，我们研究了该融合质粒的生物学特性,评估了携带mcr-1多重耐药融合质粒在宿主菌中的适应性、融合和扩散能力,旨在为多重耐药融合质粒介导mcr-1传播的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株信息

大肠杆菌D72菌株分离自猪肛门拭子样品;接合实验得到携带融合质粒pD72C(blaCTX-M-55阳性F33∶A-∶B-型质粒pD72-F33与mcr-1阳性类噬菌体质粒pD72-mcr-1的共整合质粒)的接合子D72C、携带pD72-F33质粒的接合子D72C-2。标准菌E.coli25922及工程菌E.coliDH5α、E.coliC600、E.coliJ53为本实验室保存。采用微量肉汤稀释法测定原菌、受体菌及接合子的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)。

1.2 质粒转化实验

用小提质粒试剂盒分别提取两个接合子的质粒,通过电转化分别将质粒转入受体菌E.coliDH5a中,获得携带pD72C的转化子D1和携带pD72-F33的转化子D2。

1.3 生长曲线测定

将接合子D72C、D72C-2和E.coliC600划线培养后,分别挑取单菌落到2 mL空白LB肉汤中,于37 ℃下以200 r/min的转速过夜培养。分别测定接合子D72C、D72C-2的母液的OD值,取OD值最接近的母液进行下一步实验。从母液中吸取200 μL接种到含20 mL新鲜LB肉汤的锥形瓶中,在37 ℃下以200 r/min震荡培养。每隔1 h准确吸取200 μL到96孔板中,平行吸取3次,以空白的LB肉汤作为空白对照,测定在600 nm处的吸光值OD600。

1.4 质粒稳定性实验

将接合子D72C和D72C-2分别划线于LB琼脂培养基上,在37 ℃下过夜培养。挑取单菌落，将其接种至50 mL无抗LB肉汤中，过夜传代培养,每株菌3个平行。吸取50 μL培养液，重复接种至新的50 mL无抗LB肉汤中，连续传代9 d。每隔1 d进行1次检测,吸取20 μL细菌培养液,用灭菌生理盐水倍比稀释到合适浓度,在无抗LB琼脂培养基上均匀地滴稀释液,每个稀释梯度滴3个平行,过夜培养。参照本课题组先前研究报道[4]中的引物,对在无抗LB琼脂平板上生长的所有菌落进行PCR鉴定。

1.5 体外竞争性实验

为了评估融合质粒pD72C和亲本质粒pD72-F33对宿主适应性的影响,采用转化子D1、D2与E.coliDH5a进行体外竞争实验。挑取D1和E.coliDH5a,分别接种于2 mL无抗LB肉汤中,于37 ℃、200 r/min摇床上培养12～16 h。取OD600值最相近的初始培养物母液,以1∶1的比例均匀混合。分别取100 μL混合液接种到100 mL空白LB肉汤中(1∶1000),同时设4个平行,设此时为竞争性实验0 h。于37 ℃、200 r/min条件下震荡培养24 h后,取混合液100 μL接种到100 mL新鲜空白LB肉汤中(1∶1000)。此操作每24 h重复1次,连续4 d。在培养的0、24、48、96 h时,对混合培养物各取50 μL培养液,利用灭菌生理盐水将其倍比稀释到合适的浓度，然后涂布于无抗LB琼脂板,在37 ℃下培养14～18 h。将从LB琼脂板上获得的单菌落全部转接到2 μg/mL粘菌素LB琼脂板上,于37 ℃恒温下培养14～18 h。参照文献[4]报道的引物,进行菌落PCR鉴定。转化子D2的体外竞争实验也进行相同的操作。最后,参照文献[15]的报道,根据以下公式计算相对适应度RF：RF=(lgS1d1-lgS1d0)/(lgS2d1-lgS2d0),式中S1d1和S1d0分别是转化子在24、48、72、96和0 h时的菌落数；S2d1和S2d0分别是DH5a在24、48、72、96和0 h时的菌落数。当RF>1时,表明转化子相对于宿主菌有竞争优势;当RF=1时,表明质粒对宿主菌不产生适应性代价;当RF<1时,说明质粒对宿主菌造成了较大的适应性代价,转化子处于竞争劣势。体外竞争性实验重复3次,结果取RF的平均值。

1.6 质粒的融合频率和接合频率

以原菌D72为供体,以利福平抗性E.coliC600为受体,通过接合实验观察pD72-mcr-1和pD72-F33∶A-∶B-融合质粒的形成能力。分别在添加头孢噻肟(2 mg/L)和利福平(450 mg/L)的麦康凯琼脂板上，以及添加黏菌素(2 mg/L)和利福平(450 mg/L)的麦康凯琼脂板上筛选接合子。进一步以携带融合质粒pD72C和携带pD72-F33质粒的接合子D72C和D72C-2为供体,以叠氮钠抗性E.coliJ53为受体进行接合实验,在含有黏菌素(2 mg/L)和叠氮钠(100 mg/L)、头孢噻肟(2 mg/L)和叠氮钠(100 mg/L)的琼脂板上筛选J53接合子,以评价融合质粒和亲本质粒的水平转移能力。参照文献[4]报道的引物,对所有接合子进行PCR鉴定。融合频率的计算:融合频率=携带融合质粒pD72C的接合子数量/携带亲本质粒pD72-F33的接合子数量。接合频率计算:接合频率=接合子数量/ (C600数量+接合子数量)。

2 结果与分析

2.1 接合子及原菌的药敏性

从表1可以看出：原菌D72对多种药物耐药；携带融合质粒的接合子D72C对头孢喹肟和粘菌素的MIC值比受体菌分别升高了约512倍和64倍；blaCTX-M-55阳性质粒pD72-F33的接合子D72C-2对粘菌素敏感,而对头孢喹肟的MIC值比受体菌升高了约512倍。这些耐药表型与接合子携带的耐药基因一致。

表1 大肠杆菌分离株D72、接合子及受体菌的MIC值 mg/L

2.2 细菌的生长曲线

以时间(h)为横坐标,以不同时间点的平均OD600值为纵坐标,绘制 D72C、D72C-2和E.coliC600的生长曲线。最初D72C、D72C-2和E.coliC600母液的OD600值比较接近,分别为0.035、0.033和0.031。图1显示,所有菌株均在4 h时达到对数期,在10 h时达到稳定期,且各时间节点的OD600值相近,3株菌的生长曲线趋于一致,即接合子和受体菌的生长能力相似。

2.3 质粒的稳定性和竞争性

质粒的稳定性实验结果显示,在不含抗生素的环境中,融合质粒pD72C和亲本质粒pD72-F33连续传代9 d后仍能保持稳定存在,说明该质粒具有较高的稳定性,其携带的抗性基因可以稳定遗传。竞争性实验结果(图2)显示,在培养过程中,携带融合质粒pD72C的转化子D1和携带亲本质粒pD72-F33的转化子D2数量都高于受体菌E.coliDH5a的数量,相对适应度RF均大于1,说明融合质粒pD72C和亲本质粒pD72-F33对宿主菌均呈现出适应性优势。融合质粒pD72C的相对适应性高于pD72-F33的相对适应性,尤其是在96 h时,质粒pD72-F33的相对适应度性稍微降低,而融合质粒pD72C的突然增大,表现出比pD72-F33更明显的竞争优势。

2.4 质粒的融合频率和接合频率

实验结果表明：质粒的融合频率较高,为6.43×10-3；融合质粒pD72C和亲本质粒pD72-F33的接合频率分别为0.82×10-1和3.19×10-1。

3 讨论

适应性是指耐药菌在没有药物选择压力的情况下生长、定殖等方面的能力。细菌在药物的选择压力下,可以通过染色体基因突变和质粒上耐药基因的水平转移等获得耐药性以适应环境的变化,但是当药物选择压力去除后,耐药菌株中基因的突变、外源基因的表达以及质粒的导入等会对宿主菌造成负担,其适应性可能低于敏感菌,在菌群中逐渐成为劣势菌,这一现象称为适应性代价。一般说来,质粒和染色体抗性基因都会导致细菌适应性代价的产生[16]。耐药菌的适应性研究主要包括耐药菌是否能快速适应宿主或环境?能否在与敏感菌的生长竞争中成为优势菌群？质粒的稳定性是指质粒经复制后分配到子代细菌中的能力。耐药质粒在宿主菌中稳定的传代可以保证耐药性的维持,同时有更多的机会传递到其他菌中,增加耐药基因传播的机会。

本文通过融合质粒的稳定性、生长竞争性实验，以及融合频率和接合频率来研究融合质粒的生物学特征,以评估在接合过程中形成的多重耐药融合质粒对宿主菌的适应性、融合和扩散能力。本研究通过测定生长曲线、质粒稳定性、体外竞争实验来分析mcr-1阳性类噬菌体质粒与blaCTX-M-55阳性F33∶A-∶B-型质粒共整合形成的融合质粒对宿主的适应性代价。发现接合子D72C、D72C-2和E.coliC600的生长曲线基本一致,表明该融合质粒不影响宿主菌的生长能力。融合质粒和亲本质粒pD72-F33在无抗条件下能够稳定传代9 d,这表明通过共整合形成的融合质粒比较稳定,有促进多重耐药菌株形成的可能。体外竞争实验结果表明融合质粒和亲本质粒不对宿主菌产生适应性代价。何良英等[17]报道了犬源大肠杆菌7A8的F33∶A-∶B-型多重耐药质粒pHN7A8在宿主菌JM109中具有较高的稳定性和适应性。F33∶A-∶B-型质粒上存在的一些沉溺系统可以提高质粒的稳定性和适应性,这可能是F33∶A-∶B-型质粒在肠杆菌中流行的主要原因[1]。本研究发现,携带融合质粒的转化子的相对适应性高于亲本质粒的相对适应性,尤其是在培养96 h时,融合质粒的相对适应性突然增大,这表明质粒融合后,并没有因为获得较大序列片段而增加宿主的负担,反而有利于宿主的生存,其具体的原因有待进一步研究。本研究结果显示，该融合质粒具有较高的融合频率和接合频率,说明可接合性F33∶A-∶B-质粒能够以较高的频率捕获不可接合性mcr-1阳性类噬菌体质粒,进而促进mcr-1的水平传播,并且在捕获类噬菌体质粒这个较大的片段后,F33∶A-∶B-质粒自身的转移性和适应性不受到影响。本研究中携带mcr-1的类噬菌体质粒本身不具有可接合性,而该质粒通过与可接合的blaCTX-M-55阳性F33∶A-∶B-型质粒pD72-F33融合,不仅使自身具有了可接合性,而且不对宿主菌产生适应性代价,同时有着较高的融合频率和接合频率。该融合质粒所具有的良好的生物学特性可能会促使mcr-1的快速传播及多重耐药质粒的进化,这将导致多重耐药菌的产生,从而给临床感染治疗带来挑战。以后应进一步研究影响质粒融合的因素,为采取相应措施避免多重耐药融合质粒的形成及传播提供理论依据。

4 结论

mcr-1阳性类噬菌体质粒和F33∶A-∶B-质粒共整合形成的融合质粒在宿主菌中能够稳定传代,对宿主菌有较好的适应性优势,拥有较强的扩散能力。