依那普利拉通过调控TGF-β1表达对抗AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖

于 敏 孙红霞 (北华大学附属医院心内科,吉林 吉林 132013)

心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)以心肌成纤维细胞(CFb)过度增殖、胶原蛋白分泌增加为主要特征,并参与心室重塑。近年来大量资料揭示,转化生长因子-β1(TGF-β1)参与了 MF的发生、发展,其表达增多与 MF密切相关〔1,2〕。目前研究发现,依那普利拉(Ena)除具有降低血压、改善心肌供血、治疗心肌梗死等作用外,还具有抑制血管平滑肌细胞和CFb增生〔3〕的作用,其作用机制尚有待进一步研究。本实验在细胞水平上观察 Ena对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导CFb增殖、羟脯氨酸含量变化及对 TGF-β1转录和表达的影响,旨在探讨其抗MF的作用及机制。

1 材资料与方法

1.1 材料与细胞 Ena购自江苏常州制药厂;胰蛋白酶:宝泰克生物试剂;AngⅡ、四氮唑盐(MTT)均为 Sigma公司产品;IMDM培养基购自HyClone Utah公司;胎牛血清(FCS):杭州四季青;Heraeus型CO2培养箱;SUNRISE TECAN FO39300型自动酶联检测仪(澳大利亚);日本Olympus倒置显微镜;超净工作台。鼠TGF-β1cDNA序列取自 Gen Bank(NO:X76881),上游引物序列:CTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC,下游引物序列CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC,扩增的PCR产物大小为290 bp。所有引物序列均采用序列局部相似性查询系统(BLAST)软件分析,由上海生物工程公司合成;总RNA提取试剂盒,RT-PCR试剂盒:Promega;TGF-β1,S-P免疫组化试剂盒:福州迈新。出生1～3 d的 Wistar大鼠取心室,胰酶消化,收集细胞,置于含100 ml/L FCS的IMDM培养液中,在50 ml/L CO2、37℃、饱和湿度条件下培养60～90 min。采用差速贴壁法分离CFb,加入含100 ml/L FCS的IMDM继续培养。经倒置显微镜、透射电镜、免疫组化纤维黏连蛋白染色阳性和平滑肌肌动蛋白染色阴性鉴定为所需的CFb,纯度达98%,生长近融合时按1∶3传代,实验采用2～4代细胞。

1.2 方法

1.2.1 分组 共分为五组,对照组:含有IMDM的培养液;AngⅡ组:培养液中加入终浓度为 10-7mol/L的 AngⅡ;Ena(10-5mol/L)组:培养液中同时加入终浓度为10-5mol/L Ena和10-7mol/L AngⅡ;Ena(10-6mol/L)组:培养液中同时加入10-6mol/L Ena和 10-7mol/L AngⅡ ;Ena(10-7mol/L)组:培养液中同时加入10-7mol/L Ena和10-7mol/L AngⅡ。

1.2.2 MTT比色法检测CFb的增殖活力 各组细胞接种于96孔培养板,每组细胞8复孔,药物干预24、48、72 h,于培养结束前4 h加入5 g/L MTT 10 μ l,待形成蓝紫色的结晶沉淀后加入二甲基亚砜(DMSO)150 μ l使沉淀降解,在酶联免疫检测仪上490 nm波长处测定光吸收值(A值),用只加培养液不加细胞的空白孔调零。

1.2.3 羟脯氨酸测定 分组同MTT法,换用24孔培养板,药物作用24、48、72 h。步骤按试剂盒说明进行。

1.2.4 RT-PCR法检测Ena对TGF-β1表达的影响 总 RNA的提取:取对数生长期CFb 5×104个/ml,接种于6孔板中,37℃、5%CO2及饱和湿度下培养24 h,换无血清培养基,用含1%FCS的IMDM培养24～48 h,每孔分别加入不同浓度的含1%FCS的 IMDM稀释的Ena(10-7,10-6,10-5mol/L),AngⅡ处理24 h,倒掉培养液,用焦碳酸二乙酯(DEPC)生理盐水洗涤细胞2次,加入Trizol裂解液,至细胞完全裂解后,加入氯仿0.2 ml,彻底混匀后离心,吸取最上层水相,加异丙醇0.5 ml,混匀后离心沉淀RNA,再加75%乙醇除盐,离心,沉淀即为总RNA;逆转录反应:在沉淀有总RNA的各管中,分别加入10×cDNA 合成缓冲液、MgCl2、oligo(d T)、4 ×d NTP、RNA酶抑制剂,反转录酶(AMV)和去离子水,至总体积20 μ l。42℃恒温水浴1 h。PCR反应:于0.2 ml薄壁PCR管中分别加入10×PCR合成缓冲液,4×d NTP,上游引物,下游引物,cDNA模板,Taq酶和去离子水,至总体积50 μ l。混匀后,在热循环仪上进行PCR反应,条件如下:95℃孵育 5 min,然后分别 94℃1 min,50℃1 min,72℃1.5 min,共30个循环,最后72℃延伸10 min,电泳和照相;取PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳,溴乙啶染色,紫外透射反射仪观察扩增产物的大小及亮度并摄影。使用凝胶分析系统对扩增条带进行密度分析,以平均灰度值代表相应基因的表达量,并除以 β-actin的平均灰度值(β-actin为内参照),作为各扩增产物mRNA的相对表达量。

1.2.5 流式细胞仪检测 Ena对TGF-β1表达的影响 细胞固定同前,加入特异的一抗TGF-β150 μ l,空白对照为0.1%磷酸盐缓冲液(PBS),4℃孵育过夜,用 PBS洗2次,离心,弃上清,以除去非特异性结合的一抗;分别加入染色液稀释的二抗〔FITC-抗小鼠 IgG(1∶100)〕,37℃避光孵育 45 min ～1 h;300目尼龙网过滤,上机检测。根据FITC被激发出的荧光量的多少来确定细胞中 TGF-β1蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析 应用SPSS13.0统计软件,实验结果以x ±s表示,多组间的数据比较用方差分析,组间比较采用 t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 倒置显微镜下CFb生长形态的改变 各处理组作用24 h后,在倒置显微镜下观察细胞形态的变化。对照组细胞胞体较大,胞质丰富,呈梭形,细胞间连接丰富,AngⅡ组增生活跃,呈编织状、火焰状,胞体增大,细胞生长密集;加入 Ena后,细胞密度逐渐降低,细胞间隙逐渐增大,细胞间连接逐渐减少,细胞体积缩小,多呈梭形或圆形,透光度降低。见图1。

图1 倒置显微镜下CFb生长形态(×100)

2.2 MTT法检测CFb的增殖活力 AngⅡ可显著提高CFb对MTT的代谢率,MTT值明显升高,与对照组相比有显著性差异(P＜0.01),可证实AngⅡ对CFb的促增殖作用。加入不同浓度的Ena后,MTT值显著低于AngⅡ组,与之比较有显著性差异(P＜0.01,P＜0.05),且呈剂量依赖性。见表1。

2.3 各组羟脯氨酸含量比较 AngⅡ组羟脯氨酸含量与对照组相比差异显著(P＜0.05);用药后,羟脯氨酸含量下降,随Ena浓度增加,有明显的量效关系;与 AngⅡ组相比,Ena 10-5mol/L、Ena 10-5mol/L 24 h、Ena 10-5mol/L 48 h差异相当显著(P＜0.01),72 h差异显著(P＜0.05)。见表2。

2.4 RT-PCR检测 CFb的 TGF-β1mRNA转录水平 AngⅡ能够从转录水平上增加TGF-β1表达,与对照组相比差异显著(P＜0.05)。Ena三个剂量组均能降低 TGF-β1转录,与 AngⅡ相比具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。见表3。

表1 MTT法检测CFb的增殖活力(±s,n=8)

表1 MTT法检测CFb的增殖活力(±s,n=8)

与对照组比较:1)P＜0.05,2)P＜0.01;与AngⅡ组比较:3)P＜0.05,4)P＜0.01

组别 24 h 48 h 72 h对照组 0.265 1±0.040 3 0.254 3±0.065 3 0.115 3 ±0.010 6 AngⅡ组 0.300 0 ±0.038 31)0.344 9 ±0.020 32)0.182 0 ±0.020 71)AngⅡ +Ena 10-7组0.230 8 ±0.063 63)0.329 0 ±0.03043)0.170 6 ±0.015 0 AngⅡ +Ena 10-6组0.230 3 ±0.036 63)0.287 3 ±0.025 03)0.156 8 ±0.010 2 AngⅡ +Ena 10-5组0.228 0 ±0.042 84)0.220 6 ±0.056 04)0.140 2 ±0.014 54)

2.5 FCM检测CFb的TGF-β1蛋白表达 AngⅡ组 TGF-β1蛋白表达量明显升高,与对照组比较差异显著(P＜0.05);Ena三个剂量组均不同程度降低了TGF-β1蛋白表达,与AngⅡ组相比较差异显著(P＜0.05或P＜0.01)。见表3。

2.6 TGF-βmRNA与 TGF-β蛋白表达量相关性分析TGF-β1mRNA表达量与 TGF-β1蛋白含量呈现明显正相关性,r=0.808 9,P ＜0.01。说明TGF-β1蛋白含量随 TGF-β1mRNA增加而增加,表明AngⅡ能够在转录水平上增加 TGF-β1合成,通过TGF-β1mRNA增加进而增加 TGF-β1蛋白表达,从而促进MF的发生。见图2。

表2 各组不同时点羟脯氨酸含量比较( ±s,μ g/mg,n=8)

表2 各组不同时点羟脯氨酸含量比较( ±s,μ g/mg,n=8)

与对照组比较:1)P＜0.05;与AngⅡ组比较:2)P＜0.05,3)P＜0.01;下表同

组别 24 h 48 h 72 h对照组 1.26 ±0.36 1.74±0.34 1.65±0.65 AngⅡ组 2.27±0.54 1)2.31±0.351)2.36 ±0.201)AngⅡ +Ena 10-7/L组 1.27±0.57 2)1.40±0.372) 1.79±0.56 AngⅡ +Ena 10-6/L组 1.21±0.23 3)1.36±0.422)1.72 ±0.302)AngⅡ +Ena 10-5/L组 1.15±0.65 3)1.28±0.433)1.67 ±0.252)

表3 Ena对CFb的TGF-β1 mRNA 及蛋白水平的影响±s,n=6)

表3 Ena对CFb的TGF-β1 mRNA 及蛋白水平的影响±s,n=6)

组别 TGF-β1/β-actin TGF-β1(/10 000 个细胞)对照组 0.35±0.07 1 514±366 AngⅡ组 0.87±0.21 1) 2 025±257 1)AngⅡ +Ena 10-7组 0.63±0.16 2) 1 810±345 2)AngⅡ +Ena 10-6组 0.42±0.07 3) 1 726±284 2)AngⅡ +Ena 10-5组 0.37±0.06 3) 1 646±243 3)

图2 TGF-β1 mRNA与蛋白表达相关性关系

3 讨 论

MF是以心脏间质成纤维细胞过度增殖和胶原过度沉积及异常分布为特征的心脏间质重构。AngⅡ通过作用于CFb上的Ang受体(AT1),引起CFb增殖和胶原合成增加,导致MF发生〔4〕。本实验结果显示,给予Ena后,可使 AngⅡ作用下的CFb MTT-OD值显著降低,同时胶原含量明显下降,表明Ena可以抑制CFb增殖并可剂量依赖性地抑制AngⅡ诱导的胶原分泌。

TGF-β1是导致 MF诸多因素最后的共同中介之一,能使体外培养细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达增加,并增加Ⅰ型胶原m RNA的稳定性。近年研究发现,TGF-β1和AngⅡ之间有密切作用,在MF过程中,AngⅡ增加TGF-β1基因的表达,而 TGF-β1则抑制细胞外基质(ECM)降解、增加ECM mRNA表达和蛋白质合成〔5〕。TGF-β 在心肌中对于细胞增殖、分化、迁移和 ECM的沉积均有重要的作用。TGF-β1受体在心肌细胞和非心肌细胞均有分布〔6〕,实验证明新生鼠心肌细胞表面存在 TGF-β1Ⅰ 型、Ⅱ型和 Ⅲ 型受体〔7〕,TGF-β1受体还存在于 CFb〔8〕。 Yao等〔9〕发现在CFb中,TGF-β1可激发胶原酶和胶原酶启动子的活性。有实验证明AngⅡ通过 TGF-β1诱导ECM的合成〔10〕。

Ena是依那普利的活性形式,可抑制CFb的增殖和胶原合成,但Ena干预下的CFb的TGF-β1mRNA和蛋白表达量的变化及其与MF的关系报导不多。本实验结果表明:AngⅡ组TGF-β1mRNA及其蛋白表达量明显升高,用药后Ena各剂量组TGF-β1mRNA和蛋白表达量均不同程度降低,与 AngⅡ组相比差异显著,对TGF-β1转录水平和蛋白表达的相关性分析表明,二者呈显著正相关,表明TGF-β1表达水平的升高是由于其转录活性增强所致,Ena通过抑制CFb的TGF-β1转录水平从而抑制TGF-β1蛋白表达。

由上可知,TGF-β1通过抑制ECM 降解,促进胶原合成,诱导MF的发生;而 Ena通过抑制TGF-β1的转录和蛋白表达,剂量依赖性地降低胶原蛋白的合成和分泌,拮抗AngⅡ的部分生物活性,抑制CFb增殖及胶原合成,从而抑制MF的发生。

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