葡萄籽原花青素对肺癌放射增敏作用的实验研究

张小芳，赵健雄

（1.兰州市第一人民医院，甘肃 兰州 730050；2.兰州大学中西医结合研究所，甘肃 兰州 730050）

葡萄籽原花青素对肺癌放射增敏作用的实验研究

张小芳1，赵健雄2

（1.兰州市第一人民医院，甘肃 兰州 730050；2.兰州大学中西医结合研究所，甘肃 兰州 730050）

目的 研究葡萄籽原花青素提取物对肺癌SPC-A-1细胞X射线放疗的增敏作用。方法 应用MTT法和集落形成法研究葡萄籽原花青素放疗增敏效应，单因素方差分析确定增敏剂量和增敏作用，单击多靶模型曲线拟合计算增敏比及相关参数。结果 MTT法检测结果表明，单独应用葡萄籽原花青素对SPC-A-1细胞抑制作用较弱；细胞药物处理后对X射线的敏感性增强，单因素方差分析表明药物和X射线有协同作用（P＜0.05），药物剂量为100μg/ml时表现出增敏效应。集落形成法结果表明，药物剂量为100μg/ml对X射线增敏作用明显，增敏比为2.56。结论 葡萄籽原花青素对肺癌SPC-A-1细胞有显著的放疗增敏作用。

葡萄籽原花青素；肺癌SPC-A-1细胞；实验研究

原花青素（PC）是由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成的一大类酚类化合物，广泛分布于植物界，许多食品和饮料中都含有丰富的原花青素。1970年，原花青素首次从葡萄籽中提取成功。原花青素有非常强大的抗氧化和清除自由基的能力。据报道，其在体内抗氧化能力是VE的50倍、VC的20倍；具有多种药理作用，如抗炎、抗肿瘤、保护心血管系统、抗衰老等[1]。其中葡萄籽原花青素提取物（GSPE）为最早提取成功的原花青素，对其研究也最为广泛，由于其安全（口服急性毒性LD50＞5 000 mg/kg，急性皮肤毒性2 000 mg/kg)、高效和高生物利用率等，使原花青素在食品、医药、化妆品等领域得到广泛应用[2]。

据报道，原花青素对皮肤癌、口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌等都有一定的预防或治疗作用，但单独应用疗效并不理想。基于此，我们研究了GSPE对于肺癌的放疗增敏作用，为扩大GSPE的临床应用和肺癌的放射增敏治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

GSPE：天津市尖峰天然产物研究开发有限公司产品；小牛血清:杭州四季青公司产品；RMPI-1640培养基干粉:GIBCO公司产品；噻唑蓝（MTT）:SIGMA公司产品。

1.2 仪器

倒置相差显微镜:OLYMPUS IX70,OLYMPUS公司产品;BIO-RAD iMark自动酶标仪（日本）。1.3方法

1.3.1 MTT法检测GSPE对X射线增敏作用 取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化，吹打均匀，计数，稀释至5×104个/毫升，细胞悬液以每孔90 μl接种至96孔板，培养贴壁24h后加药处理。实验设阴性对照组、空白对照组、原花青素各剂量组、原花青素各剂量颜色对照组，每孔90 μl加药，每个浓度设3个复孔。阴性对照组和空白对照组加pH 6.8的磷酸盐缓冲液，置培养箱培养24h后进行X射线照射。

照射参数：6MeV直线加速器下，在2.5Gy/min时以不同剂量X射线照射，源皮距为100cm。照射结束后继续培养4d，取出每孔中加入MTT 10μl（5mg/ml），再培养4h后，吸去培养液，加入二甲基亚砜（DMSO）150μl，震荡 10min，酶标仪单波长 490nm测定每孔吸光度值 (OD)。按下列公式计算抑制率（IR

1.3.2 集落形成法检测GSPE对X射线照射后细胞增殖的抑制作用 取对数生长期的各组细胞，0.25%胰酶消化制备细胞悬液。60mm培养皿中分别按药物剂量不同种入不同数量的细胞。细胞贴壁后，分别给予不同剂量药物（0、25、100、200μg/ml）作用24h，再给予0、1、5、9Gy剂量X射线照射，每组3个复孔。照射后置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养8～10d。取出后倒去培养液，PBS漂洗2次，用醋酸甲醇固定，姬姆萨染色10min,在解剖镜下计数直径大于50mm（或含50个细胞以上）的细胞克隆。按以下公式计算存活分数：存活率=（某剂量的集落形成数/某剂量下种植的细胞数）×100%

1.4 统计方法

MTT法各组吸光度值差异采用单因素方差分析，SPSS 13.0统计软件录入数据。集落形成存活率分析采用单击多靶模型曲线拟合，Graphpad Prism 5.0软件录入数据。

2 结果

2.1 MTT法检测GSPE增敏杀伤作用

检测不同药物浓度在不同剂量X射线照射下的增敏作用，抑制率结果见表1。对数据进行单因素方差分析，结果表明，X射线和GSPE均可显著影响肿瘤细胞的存活率，并且二者之间存在协同关系，有显著性差异（P＜0.01），但对细胞杀伤的作用不同。为进一步分析二者之间的相关性，固定其中一个因素水平即药物剂量，研究各剂量药物的增敏作用。结果表明，在药物剂量小于25μg/ml时，药物对肿瘤细胞没有杀伤作用，药物剂量也无增敏作用；药物剂量为50μg/ml时，药物对肿瘤细胞无杀伤作用，但有增敏作用；药物剂量为100μg/ml时，药物对肿瘤细胞有杀伤作用，同时也有增敏作用；药物剂量大于200μg/ml时，药物对肿瘤细胞的杀伤作用强于X射线，表现为协同作用。所以药物剂量50～100μg/ml可以认为是GSPE的有效增敏浓度。

2.2 集落形成法研究药物和X射线对肺癌细胞的增殖抑制作用肿瘤细胞具有无限增殖的潜力，但以药物干预或X射线照射后会使部分未立即死亡细胞在继续分裂数代后停止增殖。集落形成法观察细胞的增殖抑制作用结果见表2。以“多靶单击模型”进行曲线拟合，“多靶单击模型”方程：SF=1-（1-e-D/D0）N,Dq=D0lnN，其中SF为存活分数，D为放射剂量（Gy），D0代表平均致死量，Dq代表准域剂量，N为外推数，结果见表3。

3 讨论

表1 MTT法检测GSPE合用X射线对SPC-A-1细胞的抑制率（±s）

表1 MTT法检测GSPE合用X射线对SPC-A-1细胞的抑制率（±s）

药物剂量（μg/ml）X射线剂量（Gy）0 1 3 5 7 9 12.5 25 50 100 200 400 800 0.00±0.35 4.51±0.05 7.57±1.22 24.31±7.53 44.58±2.27 51.57±0.51 55.18±1.24 0.00±2.46 3.32±4.69 14.10±1.26 37.37±2.71 44.68±1.61 54.75±1.77 57.93±2.33 0.00±2.07 2.29±3.80 10.66±2.32 40.48±2.35 53.46±1.73 67.50±1.33 68.42±0.18 0.00±3.44 5.46±1.09 13.76±9.98 35.35±6.02 58.04±1.25 68.41±1.31 71.25±0.03 4.50± 6.22 11.36± 0.79 21.82±11.30 45.09± 3.91 77.47± 0.14 86.29± 2.73 87.90± 1.07 17.36±0.26 25.06±0.05 41.38±1.05 56.55±2.20 75.50±0.31 83.01±0.16 83.05±0.63

表2 集落形成法测定药物和X射线对肺癌细胞的抑制率

表3 100μg/mlGSPE剂量增敏曲线分析

恶性肿瘤是危害人类生命和健康的一种严重疾病，其防治已成为世界性的保健与医学问题。其中癌症的放射治疗方法越来越受到人们的重视，同时放射治疗也是肺癌的主要治疗手段。但放射治疗不可避免地存在放射抗拒，也是影响放疗治疗剂量的主要因素之一。20世纪60年代初，开展了对放射增敏剂的研究，能够对乏氧细胞有特定的细胞毒性作用，而对有氧的正常组织无毒性，我国自主研发的新药甘氨双唑钠对鼻咽癌、食管癌均有较好疗效，安全性较高，但部分Ⅱ期临床试验结果并不令人满意，抑制肿瘤的总有效率与单用放疗无显著性差异，同时能否降低放射剂量值得商榷。因此，减轻和预防放射性肺损伤的发生，对提高患者的生活质量和预后具有重要意义。近年来的研究显示，原花青素不仅可抑制皮肤癌、口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌等多种肿瘤细胞的生长，诱导多种肿瘤细胞凋亡[3]，而且可以拮抗化疗药物对正常细胞的毒性作用[4]。有学者研究发现，原花青素对肺癌有治疗作用，对肺癌细胞和大鼠多脏器癌症模型的肺癌均有较好的治疗和预防作用，因此，本实验设计研究GSPE的放疗增敏作用。实验结果表明，GSPE对肺癌SPC-A-1细胞有较好的放疗增敏作用，增敏剂量在50～100μg/ml之间，低于该剂量增敏效果不显著。在增敏剂量下对单独X射线照射和药物作用后X射线照射细胞存活分数进行曲线拟合，结果表明，GSPE对X射线有显著的增敏作用，药物作用后D0值降低，表明细胞对X射线敏感性增加；Dq代表准域剂量，它反映肩区的大小，表明细胞亚致死损伤修复能力。药物作用后，Dq变小，说明细胞修复亚致死损伤的能力变弱；N值减小则细胞在低剂量区时对亚致死损伤的耐受性降低，增敏比为2.56。本实验为GSPE改善肺癌放疗抵抗的临床应用提供了依据。但是GSPE对肺癌SPC-A-1细胞的增敏机理尚不明确，有待进一步研究。

[1]Debasis Bagchi，Manashi Bagchi，Sidney J Stohs，et al.Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract:importance in human health and disease prevention[J].Toxicology，2000，148:187～197.

[2]Sidhartha Ray，Debasis Bagchi，Pansy Mlim，et al.Acute and long-term safety evaluation of a novel IH636 grape seed proanthocyanidin extract[J].Research Communication in Molecular Pathology and Pharmacology，2001，109:165～197.

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R979.1

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1671-1246（2010）05-0091-02