基于Nrf2通路姜黄素抑制卡介苗感染巨噬细胞氧化应激①

赵剑秋 韩晓群 邓 琴 杨 婧 吴快英 黄 欢 （宜春学院，宜春 336000）

巨噬细胞是结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）的主要靶细胞和寄居场所，也是人体感染MTB 后免疫反应的关键免疫细胞［1-2］。巨噬细胞可通过炎症反应、脂质代谢、自噬、凋亡等一系列机制发挥抗MTB 作用，反过来，MTB 亦可通过一系列机制调控巨噬细胞的功能，以利于其在巨噬细胞内的存活和复制，其中重要机制之一MTB 对巨噬细胞氧化应激的调节。研究证实，MTB 感染会导致细胞和组织的氧化性损伤，最终引起脂质过氧化和 细 胞 死 亡［3］。活 性 氧（reactive oxygen species，ROS）的积累是活动性肺结核发生强烈氧化应激的特征之一［4］。

核因子NF-E2 相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是抗氧化应激最重要的转录因子之一［5］，通过调控下游抗氧化酶基因转录及表达产生大量保护性酶，如醌氧化还原酶1［NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，NQO1］和血红素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）等，进一步发挥抗氧化应激作用［6］。已有报道，Nrf2 激活剂能够增强MTB 感染巨噬细胞活性，降低ROS 水平，减轻细胞脂质损伤［7］。表明Nrf2信号通路可能是保护巨噬细胞免受氧化损伤的潜在靶标。

姜黄素是姜黄的主要活性成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等广泛的药理作用［8］。研究报道，姜黄素可通过抑制炎症反应增强巨噬细胞对MTB 感染的控制作用，近年来被认为是一种很有前途的抗结核药物［9-10］。但其能否通过Nrf2 通路对MTB 感染巨噬细胞氧化应激产生影响，尚未见相关报道。

由于强毒性MTB 的培养条件和安全性等方面有着多重限制，卡介苗（bacillus calmette-guerin vaccine，BCG）来源于牛型MTB，其毒性虽然相对于MTB 明显降低，但仍然能够激活宿主的免疫细胞，引起机体一系列的免疫反应，考虑到BCG 的安全性、可行性和经济性，因此BCG 广泛用于结核病细胞模型建立。

本研究通过BCG 感染巨噬细胞建立体外氧化应激模型，探讨姜黄素对BCG 感染巨噬细胞氧化应激的影响及机制，以期为探讨结核病发病机制、开展宿主导向治疗方法提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株和细胞 BCG 购于成都生物制品研究所有限责任公司；THP-1 细胞系由广东省第二人民医院传染病重点实验室友情赠送。

1.1.2 主要试剂 姜黄素（GC14787）及ML385（Nrf2抑制剂GC19254）均购自GLPBIO公司；ROS测定试剂盒（E004-1-1）及微量还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）测定试剂盒（A006-2-1）购自南京建成生物工程研究所；细胞核蛋白提取试剂盒（P0027）购自碧云天公司；BCA 蛋白定量试剂盒（PW0104）购自Biomiga 公司；超敏化学发光检测试剂盒（S6009-100 ml）购自上海百赛生物公司；Nrf2（16396-1-AP-50 μl）、β-actin（66009-1-1 g）抗体均购自Proteintech 公司；HO-1（AF1333）、NQO1（AF7614）抗体购自碧云天公司；TBP（bsm-33227M）抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分化 人源单核细胞THP-1 在37 ℃、5%CO2恒温恒湿的条件下，每隔2～3 d 以半换液方式于含1%青链霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中进行传代培养。待细胞生长至对数期，加入终浓度为100 nmol·L 的佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）诱导48 h 贴壁后，PBS 清洗细胞2～3 次以清除PMA，更换新鲜培养基进行后续实验。

1.2.2 细菌培养与计数 BCG 接种于改良罗氏培养基，置于37 ℃恒温箱培养，3～4周后培养基上可见淡黄色、菜花样菌落。无菌操作，取适量菌落置灭菌磨菌器中研磨，取适量菌悬液进行抗酸染色，显微镜下观察可见红色分枝状细菌。紫外分光光度计测定菌悬液吸光度［11］，平板计数法调整其浓度为1×108CFU/ml，分装冷藏于4 ℃冰箱1周内，备用。

1.2.3 实验分组 对照组：用含10%FBS 的RPMI-1640 完全培养液培养；BCG 组：予BCG（MOI=1∶10）干预24 h 后用不含FBS 的RPMI1640 培养液继续培养24 h；BCG+姜黄素组：用含10 μmol/L 姜黄素的完全 培 养 基 预 先 干 预4 h 后 重 复BCG 组 培 养［12-13］；BCG+姜黄素+ML385 组：用含5 μmol/L 的ML385 完全培养基预先干预24 h 后重复BCG+姜黄素组培养［14-15］。

1.2.4 荧光显微镜观察细胞内ROS 水平 按照

1.2.3 分组方法处理细胞后，采用DCFH-DA 探针对各组巨噬细胞ROS 进行检测。按照试剂盒说明，倒置荧光显微镜观察细胞绿色荧光着染情况，荧光强弱可反映细胞内活性氧水平。

1.2.5 比色法检测GSH 含量 将收集好的细胞手动研磨，取破碎后的细胞悬液加同等比例的沉淀剂混匀，3 500 r/min 离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书，测定GSH的含量。

1.2.6 Western blot 检测细胞Nrf2 及NQO1、HO-1表达 收集各组细胞置于冰上，分别抽提细胞核及胞质蛋白，BCA 法测蛋白浓度；分别取20 μg 蛋白样品上样，聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离2 h，冰上将目的蛋白转至PVDF 膜；5%脱脂奶粉溶液室温下摇床封闭1.5 h；分别加入一抗，4 ℃孵育过夜；再分别加入二抗，室温摇床孵育1 h；ECL 显影法在凝胶成像系统内曝光成像。蛋白表达量以TBP 和β-actin作内参，Image J软件进行定量分析。

1.2.7 MTT 法检测巨噬细胞增殖率 细胞接种于96孔板中，按照1.2.3分组方法处理24 h后，加入含10%MTT（5 mg/ml）的完全培养基100 μl，孵育3～4 h，加150 μl二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），室温下摇床振荡10 min，酶标仪检测各孔吸光度（OD）值。按照说明书公式计算细胞增殖率，每组设3 个复孔。

1.3 统计学处理 数据使用SPSS26.0统计软件进行分析，计量资料采用±s表示。多组独立、正态、方差齐资料组间比较采用单因素方差分析，事后两两比较采用LSD 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对BCG 感染巨噬细胞ROS 荧光强度的影响 对各组巨噬细胞DCFH-DA 染色，结果显示，与Control 组比较，BCG 感染显著增强了细胞ROS 荧光强度，证明BCG 诱导巨噬细胞产生了大量ROS；而给予姜黄素预处理后再感染BCG，细胞ROS 荧光强度较单纯BCG 感染组明显减弱；Nrf2 抑制剂ML385使得细胞内ROS荧光强度再次增强，见图1。

图1 姜黄素对BCG 感染巨噬细胞ROS 荧光强度的影响（×100）Fig.1 Effect of curcumin on ROS fluorescence intensity in BCG-infected macrophages （×100）

2.2 姜黄素对BCG 感染巨噬细胞GSH 含量的影响 采用比色法检测各组巨噬细胞GSH 含量，结果显示，与Control组比较，BCG 组GSH 含量显著降低；与BCG 组比较，加入姜黄素处理后，GSH 含量明显升高；而Nrf2 抑制剂ML385 则逆转了姜黄素的上述作用，见图2。

图2 姜黄素对BCG感染巨噬细胞GSH含量的影响Fig.2 Effect of curcumin on GSH content in BCG-infected macrophages

2.3 姜黄素影响BCG 感染巨噬细胞氧化应激的机制 为进一步研究姜黄素影响BCG 感染巨噬细胞氧化应激的机制，Western blot 检测各组巨噬细胞Nrf2及下游基因NQO1、HO-1蛋白表达。结果显示，各组细胞间Nrf2、NQO1、HO-1 蛋白表达比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。与Control 组相比，BCG感染明显降低了细胞Nrf2、NQO1、HO-1 蛋白表达（P<0.05）；采用姜黄素预处理后，BCG 感染巨噬细胞Nrf2、NQO1、HO-1 蛋白表达明显升高（P<0.01）；在BCG+姜黄素处理细胞的基础上加入Nrf2 抑制剂ML385，Nrf2、NQO1、HO-1 蛋白表达再次显著下降（P<0.01），见图3。

图3 姜黄素对BCG 感染巨噬细胞Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达的影响Fig.3 Effect of curcumin on expressions of Nrf2，NQO1 and HO-1 proteins in BCG-infected macrophages

2.4 姜黄素对BCG 感染巨噬细胞增殖率的影响

MTT 法检测各组细胞增殖率，与Control 组相比，BCG 组巨噬细胞增殖率明显下降（P<0.01）；与BCG组相比，BCG+姜黄素组巨噬细胞增殖率明显升高（P<0.01）；但BCG+姜黄素+ML385 组细胞增殖率下降（P<0.01），见图4。

图4 姜黄素对BCG感染巨噬细胞增殖率的影响Fig.4 Effect of curcumin on BCG-infected macrophage proliferation rate

3 讨论

巨噬细胞是MTB 感染后决定人类免疫功能的关键免疫细胞［16］。MTB 入侵人体后能够激活宿主免疫系统，继而激活巨噬细胞和中性粒细胞，诱导活性氧的产生［17］。研究证实，谷胱甘肽水平的降低导致人类免疫缺陷病毒感染者对MTB 的易感性增加，而补充谷胱甘肽脂质体有助于提高免疫细胞功能，控制MTB 感染［18］。证明氧化应激与结核病发病存在紧密联系。本研究采用BCG 建立感染细胞模型，结果显示，与对照组相比，BCG 感染巨噬细胞后，ROS 水平明显升高，而GSH 水平明显下降，进一步表明氧化应激在结核感染中扮演着重要角色。

有研究发现，中低剂量姜黄素不仅可以抑制ROS 的生成，而且可以提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性，促进细胞对ROS 的清除，但高剂量姜黄素则会加剧氧化应激［19］。因而本研究在BCG 感染前采用低剂量姜黄素预处理巨噬细胞，结果显示细胞内ROS 荧光强度较单纯BCG 感染组显著减弱，而GSH 水平明显升高。可见姜黄素可以通过降低活性氧水平和诱导抗氧化反应直接或间接发挥抗氧化活性［20］。

Nrf2是参与细胞抗氧化防御机制的重要转录因子［21］。当暴露于氧化应激条件下，Nrf2 从其抑制剂Keap-1（Kelch-like ECH2 associated protein 1）上解离并转运到细胞核，与抗氧化反应元件（antioxidant responsive element，ARE）结合，调控下游抗氧化酶基因的转录及表达，产生大量保护性酶，如HO-1、NQO1 等，从而减轻氧化应激引起的细胞损害［6，22］。研究发现，与Nrf2（+/-）小鼠相比，在Nrf2（-/-）小鼠巨噬细胞中，姜黄素抗氧化作用明显降低［23］。且低、中剂量姜黄素可上调Nrf2 蛋白质表达并促进Nrf2 向细胞核迁移［12］。本研究结果显示，BCG 感染降低了巨噬细胞核Nrf2 表达及下游NQO1、HO-1 水平，姜黄素能够增加BCG 感染巨噬细胞Nrf2、NQO1、HO-1 表达，进而减弱细胞氧化应激，Nrf2 抑制剂ML385 则逆转了姜黄素的上述作用。进一步支持了Nrf2 级联的激活参与了姜黄素抑制BCG 感染巨噬细胞氧化应激的机制。

研究表明，持续的活性氧可促进细胞程序性坏死和细胞死亡［24］。ROS 的产生和氧化应激可能是MTB 诱导的细胞凋亡和程序性坏死的关键上游信号［25］。本研究结果显示，BCG 感染显著降低了巨噬细胞的增殖率，姜黄素预处理细胞后，细胞增殖率明显升高，而Nrf2 抑制剂ML385 却使得细胞增殖率再度下降，表明姜黄素通过降低ROS 水平，升高GSH 表达，即通过抑制氧化应激进而抑制BCG 感染所诱导的巨噬细胞增殖率下降，但其潜在机制尚需进一步探讨。

综上所述，本研究证实了姜黄素能够抑制BCG感染巨噬细胞氧化应激反应，进而保护巨噬细胞免受氧化性损伤。这种抑制作用与Nrf2 信号通路有关，从而提示姜黄素或许可以作为抗结核治疗的潜在候选药物。