CD4+T 细胞在流感病毒感染诱发细胞因子风暴及急性肺损伤中的研究进展①

黄家望 马心悦 朱梦晨 刘薇蓉 陈雨露 李 玲 （湖南中医药大学中西医结合学院，长沙410208）

流感病毒是引起上呼吸道和下呼吸道感染的主要原因，对全球健康构成持续威胁。当前预防和治疗流感的策略主要为每年接种疫苗和使用抗病毒药物，然而，由于抗原转移和漂移导致流感病毒表面抗原频繁变化，使得流感病毒在接种疫苗后逃避抗体介导的免疫。抗病毒治疗一般只在流感感染早期的短时间段内有效，而且许多流行的流感病毒株已经对目前的抗病毒药物产生了耐药性［1］。因此，迫切需要了解流感病毒感染的病理生理学以及机体的保护性免疫反应应答机制，以开发未来的预防和治疗手段。

机体抵抗流感病毒感染及从流感病毒感染中恢复需要CD4+T 和CD8+T 细胞的作用。CD4+T 细胞通过帮助CD8+T 和B 细胞反应促进病毒清除来参与抗病毒免疫反应，是适应性免疫反应的关键参与者，在流感病毒感染诱发的急性肺损伤中扮演关键角色［2］。本文在现有研究及文献调研的基础上，就CD4+T 细胞在流感病毒感染诱发的细胞因子风暴及急性肺损伤中的影响进行重点阐述，并总结提出了此研究领域的现有挑战及前景展望。

1 流感病毒诱发细胞因子风暴的机制

甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）感染引起的呼吸道传染病是影响全球健康最大的潜在威胁，与仅在人类中发现的乙型流感病毒不同，当出现新的亚型（通常来自动物）时，IAV 会引起全球大流行［3］。在全球范围内，每年有流感病毒300～500 万例住院病例和25～50 万例病死病例［4-5］。仅在20 世纪，就记录了4 次流感大流行，最严重的“西班牙流感”，在1918～1919 年间席卷各大洲，影响了5 亿人，造成超过3 000万人病死［6］。近年来，针对流感病毒神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗流感药物已被用于预防和治疗流感病毒感染，但NA 中的某些氨基酸变化会产生耐药IAV 毒株［7-8］。由于耐药病例的增加，从而降低了当前治疗的疗效。

1.1 流感病毒在宿主内诱发细胞因子风暴的机制 在对抗流感病毒感染中，人类先天免疫系统起着至关重要的作用。一旦先天免疫系统检测到病毒RNA，就会启动一个快速的抗病毒信号级联反应，导致受感染的上皮细胞和先天免疫细胞产生各种细胞因子［9］。流感病毒RNA 在病毒感染宿主后会在宿主细胞核内复制其片段化的基因组，因此，描述病毒复制所涉及的主要分子步骤在细胞水平上更好地理解流感病毒导致细胞因子风暴发病机制至关重要［10］。流感病毒的复制循环始于血凝素（hemagglutinin，HA）与唾液酸的结合，这会触发网格蛋白介导的胞吞作用进入宿主细胞。M2 离子通道使内体的酸化触发了HA 介导的融合过程和病毒核糖核衣壳的释放，这使得负责从M1 蛋白释放病毒核糖核蛋白（Viral ribonucleoprotein，vRNP）复合物的病毒核心酸化，vRNP 可以通过使用输入蛋白-α/输入蛋白-β 两种核输入途径自由迁移到细胞核中［11］。进入细胞核后，所有基因组片段都被转录（其中两个被宿主细胞机器剪接），由RNA 依赖的RNA 聚合酶加帽和聚腺苷酸化，用于病毒蛋白质合成细胞质阶段。同时，RNA依赖的RNA聚合酶复合物与衣壳化RNA 段的前导序列结合并合成完整的互补反基因组，这将进一步用于形成新RNA 基因组片段的模板［12-13］。病毒酶在基因组复制阶段传递所有RNA 片段的转录信号。细胞质中产生的病毒核糖核复合体的结构蛋白和非结构蛋白都重新进入细胞核并组装。高水平的流感病毒M1 蛋白刺激核输出蛋白介导的新合成病毒基因组片段转移回细胞质［13］。vRNP 的核输出通道是肺细胞产生感染的另一个关键步骤，它也依赖于病毒诱导的受感染细胞中活性氧（reactive oxygen，ROS）的增加［14］。在组装阶段，核糖核衣壳与HA、NA 相互作用，在M2 介导的膜去极化后，病毒开始出芽，随后是NA 介导的病毒释放［15］。病毒出芽释放后，单核细胞/巨噬细胞大量浸润到肺中，引起的肺炎会引起大量炎症肺损伤及肺部炎症反应，进而引发“细胞因子风暴”［16］。

1.2 宿主免疫系统在流感病毒诱发的细胞因子风暴中的作用机制 在流感病毒RNA 这个复制周期中，宿主防御机制不仅仅是一个被动的旁观者，许多病原体识别受体（pathogen recognition receptor，PRR）可以将病毒RNA 识别为病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），从而促进下游细胞和体液免疫反应，产生大量细胞因子，即“细胞因子风暴”［17］。流感病毒内化到上下呼吸道上皮细胞后，可以被先天免疫传感器检测到并触发下游免疫反应过程，产生大量细胞因子。在病毒感染的细胞中直接诱导产生的细胞因子被称为主要细胞因子，在主要细胞因子中，病毒感染的肺上皮、内皮和其他免疫细胞产生Ⅰ型和Ⅲ型干扰素、IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6、IL-33 等细胞因子，主要是限制病毒复制和传播并启动下游免疫反应。在被原发细胞因子、CD8+T 细胞、NK 细胞、ILC2s、Tregs 和Th2 细胞招募和激活后，可以分泌次要细胞因子IFN-γ、IL-10、双调蛋白（amphiregulin，AREG）和IL-5 来消除病毒和病毒感染细胞，抑制炎症并恢复肺功能［18］。在免疫反应的适应性阶段，不同的T细胞亚群被激活和调节以分泌促进病毒清除、组织稳态和肺修复的次级细胞因子。正如1918 年流感大流行期间观察到的病例中描述的那样，原发性病毒性肺炎的肺损伤主要是由于炎症细胞因子的过度产生，但这些细胞因子主要是由肺细胞中的病毒复制有效触发Ⅱ型肺泡细胞、肺巨噬细胞，或在某些情况下由内皮细胞激活释放［19-20］。在这种情况下，活化的巨噬细胞和受感染的树突状细胞（dendritic cell，DC）都进一步引发了大量的免疫反应和“细胞因子风暴”［21-22］。研究发现，严重的细胞因子释放可循环至全身并导致全身细胞因子风暴，这可能不仅导致急性肺损伤，甚至导致多个器官功能障碍［23］。

以上既往研究表明，流感病毒诱发过激免疫反应介导的“细胞因子风暴”过度释放多种细胞因子（图1），进而引发的急性肺损伤是严重季节性大流行的流感病毒与高致病性禽流感病毒的临床重症病例甚至病死的重要原因。

图1 流感病毒诱发细胞因子风暴机制Fig.1 Cytokine storm mechanism induced by influenza virus

2 CD4+T 细胞在流感病毒诱发细胞因子风暴与急性肺损伤的机制研究

2.1 CD4+T 细胞在流感病毒诱导的急性肺损伤中的作用机制 流感病毒是一种主要侵袭人上呼吸道和下呼吸道上皮细胞的呼吸道感染性病原体［24］。流感病毒感染有可能在受感染的宿主中引起过度的肺部炎症和大量的组织损伤。近年来的研究表明，肺效应T 细胞和抗原呈递细胞（antigen-presenting cell，APC）之间的局部相互作用在指导效应T 细胞的积累、分化和功能方面发挥关键作用［25］。传统的CD4+T 细胞和CD8+T 细胞以及非常规的先天性T细胞对感染做出反应，并为清除病毒感染细胞和解决肺部炎症和损伤做出重要贡献。

与仅限于对病毒感染细胞进行细胞毒性杀伤的CD8+T 细胞相比，CD4+T 细胞在对感染的反应中发挥更加多样化的作用。CD4+T 细胞通过产生细胞因子，将免疫系统的其他细胞募集到感染部位，以帮助应对病原体，以及为B 细胞和CD8+T 细胞提供帮助来协调适应性免疫反应［26-27］。对于抗原识别，CD4+T 细胞依赖于与APC 的相互作用，APC 以与MHCⅡ类分子结合的短线性肽的形式吸收、处理和呈递抗原［28］。另一方面，CD4+T 细胞通过介导流感病毒感染细胞的细胞溶解直接发挥效应功能，流感病毒感染后，病毒特异性CD4+T 细胞作为长寿命记忆细胞群可以维持对病原体特异性抗体的刺激作用，具有增强的防止继发感染的能力，当再次遇到抗原时能做出更迅速和更强烈的反应［29］。研究发现，在流感感染的小鼠模型中，记忆CD4+T细胞已被证明可以独立于B 细胞和CD8+T 细胞介导的保护性反应之外［30］。除了帮助CD8+T 细胞和B 细胞发挥作用外，CD4+T 细胞还表现出抗流感病毒感染的直接效应活性，近期研究发现，肺部CD4+T细胞表达细胞溶解分子，如颗粒酶B（Gzmb）和穿孔素，并表现出对流感病毒感染细胞的直接细胞毒性，同时，流感特异性CD4+T 细胞中Gzmb 和穿孔素表达的上调仅限于感染部位，表明肺部炎症微环境促进了这些细胞毒性CD4+T细胞的产生［31］。

综上所述，CD4+T 细胞对流感病毒感染引起的肺部炎症及肺损伤有显著影响，CD4+T 细胞作为免疫系统的关键组成部分，通过产生大量细胞因子及协调其他免疫细胞和非免疫细胞的作用，在整个生命中防御流感病毒感染等方面发挥关键作用。

2.2 CD4+T 细胞在细胞因子风暴发生进展中的作用机制研究 胸腺支持T细胞是从骨髓造血干细胞分化的T 祖细胞发育而来，并选择成熟的CD4+T淋巴细胞和CD8+T 淋巴细胞［32］。定量估计表明，健康成年人用大约2.2×1011个成熟的CD4+T 细胞，其中大多数存在于外周淋巴器官中，通过抗原提呈细胞的协调作用帮助B 细胞和CD8+T 细胞发生免疫应答反应［27，33］。CD4+T 细胞的数量在人体内包括IL-7在内的机体稳态机制保持恒定［32］。但由于细胞死亡、半衰期缩短或产生受损，总CD4+T细胞可能会耗尽。此外，循环CD4+T 细胞的比例可能会通过炎症部位的淋巴组织重新分布而减少［34］。据报道，某些新型冠状病毒感染（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）患者发展至细胞因子风暴时，其免疫组化结果显示，脾脏和淋巴结中包括CD4 和CD8 亚型在内的T淋巴细胞数量远低于正常值，此外，患者体内单核细胞和巨噬细胞增加，这就解释了促炎细胞因子水平升高的现象［35］。

CD4+T 细胞受到抗原刺激后，可分化成Th1、Th2 和Th17 细胞等不同亚型，其中Th1 细胞调节巨噬细胞的募集，Th2 细胞募集嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，Th17 细胞募集中性粒细胞［36］。Th1 细胞产生大量干扰素-γ，诱导迟发性超敏反应，激活巨噬细胞，并且对于防御细胞内病原体至关重要。Th2细胞分泌大量IL-4、IL-5 等细胞因子，参与体液免疫应答。Th17 细胞分泌IL-6 和IL-17，参与炎症反应和自身免疫性疾病［37-38］。具有不同细胞功能的CD4+T 细胞亚型，是在病原体刺激下分化而成，并释放大量细胞因子，这类细胞因子在细胞因子风暴中水平升高，在细胞因子风暴中发挥重要作用［39］。

综上所述，CD4+T 细胞在机体细胞因子风暴中起关键作用，CD4+T 细胞受到病原体刺激后在体内不同条件下分化形成具有不同细胞功能的亚型，分泌大量细胞因子，在机体抗病原体感染方面发挥着重要作用。

2.3 CD4+T 细胞在流感病毒诱发细胞因子风暴与急性肺损伤的机制研究 IAV 感染可以引起中重度急性呼吸道疾病，并且是全球发病率和病死率的重要原因［40］。研究表明，CD4+T 和CD8+T 细胞在对流感的适应性免疫反应中发挥着重要作用，肺效应CD4+和CD8+T细胞利用多种效应和调节机制来消除病毒感染的细胞，并调控肺部的炎症和损伤［25］。

细胞因子风暴涵盖了多种免疫失调疾病，其特征是全身症状、全身炎症和多器官功能障碍，如治疗不当，可导致多器官功能衰竭。细胞因子风暴的发生和持续时间因病因和治疗方法不同，但细胞因子风暴的晚期临床表现会趋同并且经常重叠［41］。几乎所有的细胞因子风暴患者都会发热，严重的可能是高烧，此外，患者可能有疲劳、厌食、头痛、皮疹、腹泻、关节痛、肌痛和神经精神症状，这些症状可能直接由细胞因子诱导的组织损伤或急性期生理变化引起，也可能由免疫细胞介导的反应引起［42］。许多患者有呼吸系统症状，包括咳嗽和呼吸急促，可发展为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），伴有低氧血症，甚至可能需要机械通气［43］。在固有免疫反应最初的逃逸之后，流感病毒的识别促进肺DC 迁移到淋巴结，将抗原呈递给经过的T 细胞，从而形成更强大的抗原特异性T 细胞和B 细胞产生适应性反应。在此反应期间，可溶性介质通过与靶细胞表面的特定受体结合，在细胞功能和信号转导中发挥作用，CD8+T 细胞产生过量的TNF-α 和IFN-γ，导致直接组织损伤，而活化的CD4+T细胞，在TGF-β和IL-6作用下，分化为Th17-细胞亚群，对消除细胞外病原体和保护自身免疫起重要作用，它们主要靶向巨噬细胞、DC、内皮细胞和成纤维细胞，以增加IL-1、IL-6 和TNF-α 的产生［44-45］。在细胞因子风暴综合征的情况下，CD4+T细胞的过度激活以及细胞因子和趋化因子的产生会在组织水平产生不受控制的过度炎症损伤，导致局部和远处损伤［46］。研究发现，炎症增加与外周血淋巴细胞减少、淋巴细胞与中性粒细胞比率显著下降以及CD4+T细胞功能障碍有关［47］。

综上所述，可以推测，流感病毒感染人体时，主要侵入上下呼吸道上皮细胞，肺部抗原识别细胞识别病原体时，将抗原提呈至T 细胞，刺激T 细胞成熟，成熟T 细胞中CD4+T 细胞识别由MHCⅡ类分子提呈的抗原肽，产生大量细胞因子，形成“细胞因子风暴”，进而造成急性肺损伤，重者甚至造成ARDS。

3 现有挑战及前景展望

本文通过对CD4+T细胞、细胞因子风暴、流感病毒及其引起的急性肺损伤的相关文献进行分析，明确了流感病毒感染会激活CD4+T 细胞，刺激其产生大量细胞因子，导致过激的免疫反应和免疫失调，即“细胞因子风暴”，进而引发急性肺损伤，甚至ARDS。基于现有研究，本文从两个方面阐述CD4+T 细胞在研究新型有效抗流感病毒及治疗其引起的急性肺损伤方法的现有挑战：①抗病毒药物对病毒后代施加选择压力，促进其突变和选择，从而使病毒产生耐受性；其次，与包括流感在内的急性病毒性呼吸道疾病相关的急性肺损伤是病毒在其感染的裂解细胞中的内在毒力和可能损害组织并促进细胞因子风暴的免疫反应强度相结合的结果，因此，研发既对病毒有效，同时对细胞因子风暴或免疫介导的损伤能有效缓解的抗病毒药物是一大挑战［48］；②细胞因子风暴是一种让免疫系统短时间内火力全开的一种求助信号，虽然能够损伤病毒，但也会给机体本身留下许多连带伤害，如何从免疫调控的角度，调控细胞因子风暴发生发展有待进一步研究阐明［49］。

本文通过大量文献分析，对细胞在研究新型有效抗流感病毒及治疗其引起的急性肺损伤方法总结出以下两点展望：①现有研究说明了流感病毒感染引发机体免疫反应时，CD4+T 细胞受到病原体刺激活化，产生大量细胞因子，若能有效实时观测CD4+T 细胞［39，45］，了解其在流感病毒感染及其引发的急性肺损伤中的完整作用机制并加以区分，CD4+T 细胞或可作为一种标志物以明确流感病毒感染程度并评价预后；②现有研究说明，中医药在抗病毒和调控细胞因子风暴的发生发展方面疗效显著［50-51］，DING 等［52］发现莲花清瘟胶囊在抗流感病毒中起单独抗病毒作用，可协同西药抗病毒；YANG等［53］发现清肺排毒汤通过调节TLR4-NF-κB 信号通路，抑制细胞因子的释放，从而调控细胞因子风暴的进展，进而减轻肺部炎症损伤，因此，是否能借鉴中医“扶正祛邪”“未病先防”理论，运用中医药早期干预的显著疗效，既可有效抗病毒，又能调控细胞因子风暴发生发展。