多重PCR高分辨熔解分析同时检测骨髓增殖性肿瘤JAK2，MPL及CALR基因突变的初步研究

杨晓慧，许 蕾，晏耀明，李建新

（1.北京大学深圳医院 a.检验科；b.血液科，广东深圳 518036；2.深圳大学总医院检验科，广东深圳 518055）

骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms，MPN)是一组起源于造血干细胞、骨髓一系或多系克隆性过度增殖为特征的慢性血液肿瘤。费城染色体阴性的经典MPN 的分子基础已基本阐明[1]：由于MPN 限制性驱动基因[包括 Janus 激酶2（janus kinase 2,JAK2）、钙网素（calreticulin,CALR）和骨髓增殖性白血病（myeloproliferative leukemia,MPL）] 病毒突变，导致不正常地激活JAK2/STAT通路和下游通路，引起血细胞过度增殖[1]。根据2016 年WHO 关于髓系肿瘤和急性白血病分类标准，JAK2，CALR 和MPL 突变是经典MPN 的主要诊断标准之一[2]。JAK2，CALR 和MPL 基因突变的检测方法很多，大多基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR），大多数方法只能检测单一基因突变。PCR-高分辨熔解分析（high resolution melting assay,HRM）是一种在PCR 体系基础上加入双链DNA 结合染料，PCR 结束后直接运行HRM，根据扩增子的解链温度不同，应用检测仪器极高的温度分辨率来区分单个碱基差异的PCR 扩增后检测技术。本研究旨在建立一管法多重PCR-HRM 同时检测JAK2，MPL 和CALR 常见八种突变，为经典MPN 基因诊断提供一种简单、快速、闭管、低成本的检测手段。

1 材料与方法

1.1 研究对象 根据文献[1]，JAK2，CALR 和MPL常见突变包括：JAK2 外显子14 V617F，JAK2 外显子12 K539L，N542-E543 del 和E543-D544 del；MPL外显子10 W515K 和W515L；CALR 外显子9 I 型(c1092-1143 del) 和Ⅱ型 (c1154-1155 ins)。以上八种常见突变型等位基因模板，除JAK2 V617F 突变模板从临床MPN 确诊患者标本提取外，其它七种突变由Invitrogen 公司生物合成，-80℃低温冻存于质粒及含相应质粒的甘油菌中。野生型等位基因模板从健康人EDTA 抗凝血提取。

1.2 仪器与试剂 采用Lab-Aid 820 核酸提取仪，以Lab-Aid 核酸（DNA）分离试剂盒（厦门致善生物科技股份有限公司）提取全血DNA；采用2× HRM PCR Master Mix (Type-it HRM PCR Kit，Qiagen)扩增试剂；采用HR-1 高分辨率熔解曲线分析系统（Idaho Technology，USA）进行HRM 分析。

1.3 方法

1.3.1 PCR 及多重PCR：针对JAK2 外显子14 V617F，JAK2 外显子12 三种突变，MPL 外显子10 两种突变及CALR 外显子9 两种突变分别采用Primer 3 软件（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）共设计4 对引物，由Invitrogen 公司合成，见表1，并通过uMelt（https://dna.utah.edu/）软件对扩增产物的解链温度进行预测。PCR 反应采用C1000 Touch thermal cycler (Bio-Rad,USA)。

表1 PCR 引物序列

单独扩增各基因的PCR 体系包括：含Eva Green 饱和染料的2×HRM PCR Master Mix (Typeit HRM PCR Kit，Qiagen) 12.5μl，上下游引物终浓度各为0.4μmol/L，DNA 模板浓度为1ng/μl，加双蒸水至25μl。扩增JAK2 V617F，MPL 及CALR基因的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸10s，共40 个循环；72℃延伸5min。扩增JAK2 外显子12 的最适退火温度为50℃，其余反应条件同上。扩增产物经2.2g/dl琼脂糖凝胶电泳，采用Gel Doc XR 凝胶成像仪（Bio-Rad，USA）及Image Lab 3.0 成像软件进行成像分析。

多重PCR 反应体系包括：含Eva Green 饱和染料的2×HRM PCR Master Mix 12.5μl，各引物终浓度均为0.3μmol/L，突变型和野生型模板终浓度均为2ng/μl，加双蒸水至25μl。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸20s，共45 个循环；72℃延伸5min。

1.3.2 HRM 检测：PCR 扩增完成后，将15μl 扩增产物装载于PCR 毛细管（大菱公司），以10μl石蜡油（Sigma，USA）封闭，采用HR-1 高分辨率熔解曲线分析系统（Idaho Technology，USA）进行HRM 分析。熔解曲线荧光信号收集温度设定为65℃～98℃，0.5℃/s。各熔解曲线使用HR-1 anaysis tool 软件进行分析。

2 结果

2.1 PCR 结果 见图1。在适宜的PCR 反应条件下，设计的四对引物均能特异地扩增出各自相对应的目的条带，扩增的野生型与突变型产物长度均与理论相符，且扩增效率良好。

图1 各基因单独PCR 扩增产物电泳图

2.2 HRM 结果

2.2.1 各基因单独扩增HRM 结果：各基因单独扩增时扩增效率佳，荧光信号强。JAK2 外显子14 V617F，JAK2 外显子12，MPL 和CALR 的单独PCR 扩增产物经过HRM 分析，可以得到四组熔解峰，四组熔解峰之间分离良好，相互无重叠；野生型和突变型扩增子熔解温度差均在0.3℃以上。它们的PCR-HRM 曲线见图2。

2.2.2 多重PCR-HRM 体系探索结果：首先采用健康人标本（野生型）作为模板进行多重PCR-HRM实验，探索多重PCR 体系适宜的引物浓度和退火温度。结果显示，采用0.3μmol/L 和0.4μmol/L 引物浓度，55℃复性时，JAK2 外显子12 无扩增产物，0.3μmol/L 引物浓度的体系中其他各基因扩增效率皆优于0.4μmol/L 体系（图3A，黄色曲线各引物浓度均为0.3μmol/L，紫红色曲线各引物浓度均为0.4μmol/L）。在0.3μmol/L 引物浓度的条件下，55℃复性时，JAK2 V617F 及MPL 扩增效率均优于50℃，CALR 扩增效果则和50℃无区别（图3A，灰色退火温度为55℃，天蓝色退火温度为50℃）；若将退火温度降至48℃，则除CALR 外，其余基因扩增效果均不佳（图3A，深蓝色退火温度为48℃）。所以，多重PCR-HRM 体系各引物浓度采用0.3μmol/L，退火温度采用55℃较为适宜。

图3 单管多重PCR-HRM 同时检测JAK2、MPL 和CALR 突变

2.2.3 多重PCR-HRM 体系突变检测：该多重PCR-HRM体系最终只实现了三个基因的同时扩增，JAK2 外显子12 在多重体系中扩增失败，71℃左右无熔解峰生成(图3A)，其余野生型基因的熔解温度皆与单独扩增时相符。

因JAK2 外显子12 在多重体系中扩增失败，后续改为对包含JAK2 V617F，MPL 及CALR 突变的标本进行多重PCR-HRM 实验。在这一多重PCRHRM 体系中，JAK2 V617F 因扩增效率低，突变型扩增子熔解峰未能与野生型区分开来（图3B，深棕色为JAK2 V617F 野生型单独扩增熔解峰，浅棕色为JAK2 V617F 杂合突变型单独扩增熔解峰，蓝色连续曲线为正常人标本，灰色连续曲线为JAK2 V617F 杂合突变标本）。

MPL 和CALR 突变型在多重PCR-HRM 体系中扩增产物的熔解温度与单独扩增时相符，但多重体系中突变基因与其他野生型基因之间相互竞争，两者的扩增效率不一，突变基因扩增效率高（图3C，蓝色为MPL W515K 单独扩增熔解峰，天蓝色连续曲线为正常人标本，紫色连续曲线为MPL W515K 合成模板+正常人标本；图3D，天蓝色连续曲线为正常人标本，黄色连续曲线为CALR 突变I 型合成模板+正常人标本，紫红色连续曲线为CALR 突变II 型合成模板+正常人标本）。

3 讨论

JAK2，CALR 和MPL 突变检测对经典MPN 的诊断、治疗监测、预后判断具有重要的临床意义[2-3]。多重PCR-HRM 是一种简单、快速、高通量、闭管、低成本的突变检测和基因分型技术，广泛用于遗传病、肿瘤、病原微生物及个体化用药的分子诊断检测[4-5]。国内外已有学者应用PCR-HRM 技术检测这三个基因中的单个或两个基因突变，如早期RAPADO等[6]对JAK2基因外显子14和12的检测，LIM 等[7]对CALR 外显子9 的检测。NUSSENZVEIG等[8]应用单管多重PCR-HRM 技术同时检测JAK 2 外显子14，12 及MPL 基因外显子10 突变；MATSUMOTO 等[9]应用这一技术同时筛选JAK2和CALR 基因突变。尚未见应用多重PCR-HRM 技术同时检测上述三个基因突变的报道。本研究尝试建立一管法多重PCR-HRM 同时检测涵盖经典MPN 90%左右基因诊断信息的上述三个基因8 种常见突变，以便为经典MPN 的基因诊断提供一种简单、快速、闭管、低成本检测手段的可能。

本研究建立的一管法多重PCR-HRM 体系可以同时良好地筛选CALR 及MPL 基因突变，但该体系未达到预期效果，不能同步扩增JAK2 外显子12，且JAK2 V617F 突变型因扩增效率低。后续实验中，这两组引物需要重新设计，设计引物时应考虑加大各组突变峰之间的解链温度差距，如可以在引物5’端加入高含量的GC 或AT 或加入探针以提高扩增产物的熔解温度[10-11]。此外，CALR 及MPL 的引物也可以进一步优化，拉大CALR Ⅱ型突变峰与野生型、MPL基因W515K与W515L突变峰之间熔解温度的差距，以便更清晰、直观地判断具体突变。