LncRNA NNT-AS1通过调控miR-582-5p/NCKAP1轴激活Hippo-YAP/TAZ信号通路促进膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭和干细胞干性影响

郎海雷，曹雷涛，贵英斌，张天禹（定州市人民医院，河北定州 073000）

膀胱癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤，起源于膀胱上皮黏膜组织，多发病于男性，近年来其发病逐渐趋于年轻化且发病率不断上升，临床治疗后易发生转移和复发，患者预后较差[1-3]。因此探究膀胱癌发病机制，找寻新的生物分子标志物，具有重要临床意义。长链非编码核糖核酸（long non-coding RNA,LncRNA）是一类长度大于200 bp 的非编码RNA，研究发现，LncRNAs 可调控肿瘤细胞中多种原癌和抑癌基因的表达，影响肿瘤的血管新生、免疫逃逸及细胞干性等，与肿瘤的生长和转移关系密切[4-6]。在膀胱癌中也曾发现，LncRNA CASC11通过miRNA-150 促进癌细胞的增殖[7]；LncRNA GClnc1 通过激活MYC 进而促进膀胱癌的侵袭能力[8]。LncRNA NNT-AS1 是近年发现在肿瘤中高表达的一类LncRNA，研究证实其异常高表达在人类多种肿瘤的恶性进展中均扮演重要角色，参与了肿瘤的发生发展[9-10]。本研究课题组前期探究也发现，LncRNA NNT-AS1 在膀胱癌中亦存在高表达，但其发挥作用的调控机制尚不明确。因此本研究探究了LncRNA NNT-AS1 对膀胱癌细胞增殖、转移及肿瘤干细胞干性的影响，并分析LncRNA NNT-AS1 可能发挥作用的分子机制，以期为膀胱癌发病机制研究提供更多依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择人正常膀胱上皮细胞SVHUC-1 和膀胱癌细胞T24，UM-UC-3，5637 和TCCSUP 均购自美国ATCC 细胞库。另选取本院收治行手术治疗的膀胱癌患者的癌组织及对应癌旁组织标本20 例，均经病理诊断确诊，患者术前未接受放化疗、免疫治疗等任何抗肿瘤治疗，未并发其他恶性肿瘤，研究获得医院伦理委员会审批通过。

1.2 仪器与试剂 逆转录试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；双荧光素酶检测试剂盒（美国GeneCopoeia 公司）；qRT-PCR 仪和LipofectamineTM2000 试剂盒（赛默飞公司）；CCK-8 试剂盒（美国Promega 公司）；乙醛脱氢酶1A1(Acetaldehyde dehydrogenase 1A1，ALDH1A1，批号36673），CD44（批号37295），Nanog（批号8823），八聚体结合转录因子4 (Octamerbinding protein 4，Oct4，批号2751），CD133（批号64362），NCKAP1（批号34327），PDZ 结合域转录共刺激因子（Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ（批号83696），Yes 相关蛋白（Yes-Associated Protein，YAP，批号14076），甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，批号5173）抗体及山羊抗兔IgG 二抗（批号4427）购自美国Abcam 公司；qRT-PCR 反应引物序列由上海生工生物设计合成。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养：人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1培养于DMEM/F12 培养液中，人膀胱癌细胞T24，5637，UM-UC-3 和TCC-SUP 培养于RPMI-1640 培养液中，37℃常规培养至汇合率达80%时进行传代。

1.3.2 膀胱癌干细胞的分离、培养和鉴定：取生长状态良好的T24 细胞，消化后用5 ml 无血清DMEM/F12 培养液 [含0.2 mg/ml B27 溶液1 ml，5 μg/ml 胰岛素0.5 ml，20 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子3 ml，20 ng/ml 表皮细胞生长因子10 μl] 培养，后将细胞置于低吸附的培养皿中，每孔5×103个，隔天更换培养液，待细胞形成体积较大的悬浮球体时进行传代。

1.3.3 细胞转染与分组：收集对数生长期T24 细胞，胰酶消化，以5×105/孔接种于6 孔板，待细胞生长融合至80%时进行转染，根据LipofectamineTM2000 试剂盒说明书将NNT-AS1 shRNA Negative Control，NNTAS1 shRNA，NNT-AS1 shRNA+miR-582-5p inhibitor，sh-NNT-AS1+miR-582-5p inhibitor+NCKAP1 siRNA 分别转染至T24 细胞，分别设为sh-NC 组、sh-NNT-AS1组、sh-NNT-AS1+inh-582-5p 组和sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1 组，培养箱中孵育8 h，然后更换为新鲜DMEM 完全培养液。

1.3.4 qRT-PCR 实验检测膀胱癌中LncRNA NNTAS1，miR-582-5p 和NCKAP1 表达水平： 使用Trizol 法提取细胞及膀胱癌组织中总RNA，逆转录为cDNA，配置PCR 反应体系，进行qRT-PCR 反应。引物序列如下，LncRNA NNT-AS1：上游引物：5’-AGTTGCACGAACTTAGTTGA-3’，下游引物：5’-AGCTTATGCGACGAATCAC；miR-582-5p：上游引物：5’-GCCGTTAGACTTGTTGAAG-3’；下游引物：5’-CTGAATCGCTCTGCTCGA-3’；U6：上游引物：5’-CTGGCTTGCGGACCAGA-3’，下游引物：5’-AAGCCTTGAAGCATTAGGCT-3’；GAPDH：上游引物：5’-ACAACCGTGCGTCTGATTTC-3’，下游引物：5’-AGCCTTCATGCACAGTGTTC-3’。采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量。

1.3.5 CCK-8 检测膀胱癌细胞增殖能力：取转染后的各组待测细胞制成细胞悬液，接种于96 孔板，每孔2×105/ml，每组设3 个复孔，分别培养0，24，48 和72 h，每孔加入CCK-8 溶液10 μl，避光孵育2 h，酶标仪450 nm 处检测各孔吸光度值（A值）。

1.3.6 Transwell 检测膀胱癌细胞迁移和侵袭能力：将50 μl 的Matrigel 胶铺于小室上室，取转染后的各组细胞用无血清RPMI-1640 培养液稀释为1×104/ml，上室中加入200µl，下室加入600 μl 含胎牛血清的RPMI-1640 培养液，培养72 h，取出小室，擦去小室内部未迁移的细胞，无水甲醛固定20 min，后用结晶紫进行染色，清洗晾干，镜下观察、拍照、计数细胞穿膜数。细胞迁移检测不用Matrigel 胶铺小室，其他步骤与侵袭检测一致。

1.3.7 干细胞成球实验检测膀胱癌干细胞成球能力：将分离培养的膀胱癌干细胞用DMEM/F12 空白培养液重悬，浓度5×103/ml，接种于低吸附性24 孔板，每孔加入600 μl 悬液，培养箱中继续培养，每周更换一次培养液，镜下观察拍照，记录细胞成球能力。

1.3.8 流式细胞术检测CD44+CD133+细胞比例：取膀胱癌干细胞将其制成细胞悬液，每管加入1×106个细胞，加入CD44 和CD133 抗体以及同型对照抗体，4 ℃避光孵育25 min，流式细胞仪上机检测。

1.3.9 LncRNA NNT-AS1 靶基因预测分析及验证：分别检索starBase 和TargetScan 数据库预测LncRNA NNT-AS1 靶向结合位点基因（miR-582-5p）及miR-582-5p 靶向结合位点基因（NCKAP1）。构建包含miR-582-5p 结合位点在内的NNT-AS1 WT和NNT-AS1 MUT 质粒及NCKAP1 WT 和NCKAP1 MUT 质粒；利用LipofectamineTM2000 转染试剂盒将所构建的质粒分别与miR-582-5p mimic 和miRNC 转染至T24 细胞；双荧光素酶基因检测试剂盒检测各组细胞荧光强度，验证LncRNA NNT-AS1 和miR-582-5p，miR-582-5p 和NCKAP1 的靶向关系。

1.3.10 Western blot 检测CD44，Oct4，ALDH1A1，Nanog 及NCKAP1，YAP，TAZ 蛋白表达：取转染后各组待测细胞，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白浓度。取蛋白样品20µg 进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离出蛋白，转移至聚偏二氟乙烯膜，封闭2 h，加入CD44，Oct4，ALDH1A1，Nanog，NCKAP1，YAP 和TAZ 一抗（1:1 000），4℃孵育过夜，次日加入二抗（1:2 000），室温孵育1 h，显影，拍照，Image J 软件分析蛋白灰度值。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0 分析数据，所有实验重复三次取平均值。采用K-S 法进行检验，实验数据符合正态分布，故采用均数±标准差（±s）表示，采用独立t检验分析两组间数据差异；单因素方差分析多组间数据差异，LSD 检验行组间两两比较；配对t检验分析膀胱癌组织及癌旁组织中表达差异；P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌组织及细胞中LncRNA NNT-AS1表达情况 结果显示，膀胱癌细胞T24，UM-UC-3，5637和TCC-SUP 中LncRNA NNT-AS1 表达水平分别为6.03±0.17，5.47±0.26，4.66±0.36 和3.02±0.20，明显高于人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1 表达的1.00±0.01，差异具有统计学意义（t=17.472～51.160，均P＜0.001）。膀胱癌组织中LncRNA NNT-AS1表达水平明显高于癌旁组织（1.15±0.21 vs 0.34±0.07），差异有统计学意义（t=16.364，P＜0.001），提示膀胱癌中LncRNA NNT-AS1 显著高表达，选取表达升高最为明显的T24 细胞进行后续研究。

2.2 膀胱癌干细胞体外培养结果 干细胞成球实验显示，DMEM/F12 空白培养液诱导的膀胱癌细胞可形成微球，见图1A。Western blot 检测显示，相比RPMI-1640 组，DMEM/F12 组膀胱癌干细胞表达标志蛋白CD44，Oct4，ALDH1A1 和Nanog 表达灰度值明显增高，差异具有统计学意义（均P＜0.001），见图1B 和表1。流式细胞术检测发现，DMEM/F12组细胞中CD44+CD133+细胞比例明显高于RPMI-1640 组（80.80%±1.90% vs 15.30%±1.02%），差异有统计学意义（t=52.609，P＜0.001），提示膀胱癌干细胞培养成功。

表1 膀胱癌干细胞标志蛋白表达水平比较（±s，n=3）

项目RPMI-1640 组DMEM/F12 组t 值P 值CD440.11±0.021.04±0.03-44.676＜0.001 ALDH1A10.09±0.011.03±0.02-72.812＜0.001 Oct40.15±0.020.96±0.02-49.602＜0.001 Nanog0.13±0.010.99±0.04-36.127＜0.001

图1 膀胱癌干细胞培养及鉴定结果

2.3 抑制LncRNA NNT-AS1 对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响 qRT-PCR 检测显示，sh-NNTAS1 组细胞中LncRNA NNT-AS1 表达水平较sh-NC组明显降低（0.29±0.07 vs 1.00±0.02），差异有统计学意义（t=-16.892，P＜0.001），提示抑制LncRNA NNT-AS1 表达的细胞系构建成功。CCK-8法检测显示，sh-NNT-AS1 组细胞A值在24，48 和72 h 时均较sh-NC 组显著降低，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表2。Transwell 实验检测显示，sh-NNT-AS1 组细胞迁移穿膜数（55.00±2.65 个 vs 354.30±7.84 个）和细胞侵袭穿膜数（45.67±2.33个 vs 303.00±9.07 个）较sh-NC 组明显降低，差异有统计学意义（t=-62.641，-47.596，均P＜0.001），见图2。提示抑制LncRNA NNT-AS1 表达可明显抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

表2 抑制LncRNA NNT-AS1 对膀胱癌细胞A 值的影响（±s，n=3）

表2 抑制LncRNA NNT-AS1 对膀胱癌细胞A 值的影响（±s，n=3）

时间点sh-NC 组sh-NNT-AS1 组t 值P 值0h0.50±0.030.54±0.02-1.9220.127 24h1.07±0.060.80±0.017.6880.002 48h1.83±0.031.18±0.0714.783＜0.001 72h2.53±0.061.89±0.0712.024＜0.001

图2 Transwell 检测抑制LncRNA NNT-AS1 对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响

2.4 抑制LncRNA NNT-AS1 对膀胱癌干细胞干性的影响 干细胞成球实验显示，sh-NNT-AS1 组膀胱癌干细胞成球数目较sh-NC 组（20.85±2.17 个vs 41.35±3.67 个）明显降低，差异有统计学意义（t=8.328，P=0.001），见图3A。Western blot 检测显示，与si-NC 组相比，sh-NNT-AS1 组膀胱癌干细胞标志蛋白CD44，Oct4，ALDH1A1 和Nanog表达灰度值明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.001），见图3B 和表3。流式细胞术检测显示，与si-NC 组相比，sh-NNT-AS1 组CD44+CD133+细胞比例（9.30%±0.79% vs 88.50%±2.77%）明显降低，差异有统计学意义（t=-47.624，P＜0.001），提示抑制 NNT-AS1 可抑制膀胱癌干细胞干性。

表3 抑制LncRNA NNT-AS1 对膀胱癌干细胞标志蛋白表达的影响（±s，n=3）

表3 抑制LncRNA NNT-AS1 对膀胱癌干细胞标志蛋白表达的影响（±s，n=3）

项目sh-NC 组sh-NNT-AS1 组t 值P 值CD441.12±0.020.04±0.0183.656＜0.001 ALDH1A11.16±0.050.23±0.0131.591＜0.001 Oct41.10±0.040.17±0.0236.019＜0.001 Nanog1.24±0.030.49±0.0330.619＜0.001

图3 抑制LncRNA NNT-AS1 对膀胱癌干细胞干性的影响

2.5 LncRNA NNT-AS1 与miR-582-5p/NCKAP1 分子轴的调控关系验证 通过检索数据库发现，miR-582-5p 与LncRNA NNT-AS1 存在靶向结合位点，见图4A。双荧光素酶报告基因实验显示，miR-582-5p mimic 明显降低了LncRNA NNT-AS1 WT 荧光质粒活性（t=72.260，P＜0.001），对LncRNA NNT-AS1 MUT 荧光质粒活性无影响（t=1.225，P＞0.05），见表4。qRT-PCR 检测显示，sh-NNT-AS1 组细胞中miR-582-5p 表达明显高于sh-NC 组（1.00±0.01 vs 0.19±0.03），差异有统计学意义（t=44.366，P＜0.001），提示miR-582-5p 是LncRNA NNT-AS1 的靶基因。

表4 荧光素酶活性比较（±s，n=3）

表4 荧光素酶活性比较（±s，n=3）

项目miR-NCmiR-582-5p mimic t 值P 值MUT1.03±0.021.01±0.021.2250.288 NNT-AS1 WT1.02±0.010.43±0.0172.260＜0.001 MUT1.01±0.021.00±0.021.5490.196 NCKAP1 WT1.00±0.030.39±0.0229.303＜0.001

图4 检索数据库预测LncRNA NNT-AS1 与miR-582-5p，miR-582-5p 与NCKAP1 结合位点

另外检索到NCKAP1 与miR-582-5p 存在靶向结合位点，见图4B；双荧光素酶报告基因实验显示，miR-582-5p mimic 明显降低了NCKAP1 WT 荧光质粒活性（t=29.303，P＜0.001），对NCKAP1 MUT 荧光质粒活性无影响（t=1.549，P＞0.05），见表4。qRT-PCR 检测显示，miR-582-5p mimic 组细胞中NCKAP1 表达显著低于miR-NC组（1.01±0.05 vs 2.00±0.02），差异有统计学意义（t=-31.842，P＜0.001），提示NCKAP1 是miR-582-5p的直接靶基因。进一步检测发现，sh-NNT-AS1 组细胞中NCKAP1 表达明显低于sh-NC 组（0.12±0.02 vs 1.45±0.03），差异有统计学意义（t=-63.891，P＜0.001）；sh-NNT-AS1+inh-582-5p 组细胞中NCKAP1表达明显高于sh-NNT-AS1 组（1.39±0.04 vs 0.12±0.02），差异有统计学意义（t=-49.187，P＜0.001），提示NNT-AS1 可能通过竞争性吸附miR-582-5p，调控 NCKAP1 表达进而发挥作用。

2.6 LncRNA NNT-AS1 调控miR-582-5p/NCKAP1 对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响 CCK-8 法检测显示，在24，48，72 h 时，sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞A值显著高于sh-NNT-AS1 组（t=6.790，11.628，5.977，均P＜0.001）；sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1 组细胞A值则显著低于sh-NNT-AS1+inh-582-5p 组（t=7.877，16.323，8.779，均P＜0.001），见表5。Transwell 检测显示，sh-NNT-AS1+inh-582-5p 组细胞迁移穿膜数（322.31±28.45 个 vs 81.42±13.22 个）和细胞侵袭穿膜数（316.07±30.21 个 vs 92.13±12.65 个）较sh-NNT-AS1 组显著增高，差异有统计学意义（t=15.115，13.158，均P＜0.001）。sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1 组细胞迁移穿膜数和细胞侵袭穿膜数分别为65.33±12.60 个和71.08±15.19 个，显著低于sh-NNT-AS1+inh-582-5p 组，差异有统计学意义（t=16.125，14.395，均P＜0.001），见图5。说明LncRNA NNT-AS1 可通过调控miR-582-5p/NCKAP1 分子轴来影响膀胱癌细胞的生长和转移。

表5 LncRNA NNT-AS1，miR-582-5p，NCKAP1 作用对膀胱癌细胞A 值的影响（±s，n=3）

表5 LncRNA NNT-AS1，miR-582-5p，NCKAP1 作用对膀胱癌细胞A 值的影响（±s，n=3）

时间点sh-NNT-AS1 组sh-NNT-AS1+inh-582-5p 组sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1 组F 值P 值0 h0.57±0.030.56±0.060.53±0.080.3580.713 24 h0.73±0.060.98±0.030.69±0.0436.443＜0.001 48 h1.22±0.051.74±0.041.01±0.07141.233＜0.001 72 h1.69±0.142.33±0.161.39±0.0840.209＜0.001

图5 Transwell 实验检测LncRNA NNT-AS1，miR-582-5p，NCKAP1 作用对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响

2.7 LncRNA NNT-AS1 调控miR-582-5p/NCKAP1对干细胞干性的影响 干细胞成球实验显示，sh-NNT-AS1+inh-582-5p 组细胞成球数目显著高于sh-NNT-AS1 组（38.55±2.20 个 vs 18.98±1.16 个），差异有统计学意义（t=14.592，P＜0.001）；sh-NNT-AS1+inh-582-5p +si-NCKAP1 组细胞成球数目为11.36±1.05 个，显著低于sh-NNT-AS1+inh-582-5p 组，差异有统计学意义（t=21.365，P＜0.001），见图6A。Western blot 检测显示，sh-NNT-AS1+inh-582-5p 组细胞CD44，ALDH1A1，Oct4，Nanog 蛋白表达显著高于sh-NNT-AS1 组（t=21.243，10.650，14.615，12.032，均P＜0.001）；sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1 组细胞CD44，ALDH1A1，Oct4 和Nanog 蛋白表达灰度值均显著低于sh-NNT-AS1+inh-582-5p 组（t=17.889，6.412，14.227，7.777，均P＜0.001），见表6 和图6B。以上结果综合分析说明，LncRNA NNT-AS1 可通过调控miR-582-5p/NCKAP1 分子轴来影响膀胱癌干细胞干性。

表6 LncRNA NNT-AS1，miR-582-5p，NCKAP1 作用对膀胱癌干细胞标志蛋白表达的影响（±s，n=3）

表6 LncRNA NNT-AS1，miR-582-5p，NCKAP1 作用对膀胱癌干细胞标志蛋白表达的影响（±s，n=3）

项目sh-NNT-AS1 组sh-NNT-AS1+inh-582-5p 组sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1 组F 值P 值CD440.10±0.011.05±0.080.25±0.05260.833＜0.001 ALDH1A10.22±0.021.20±0.160.61±0.1157.504＜0.001 Oct40.19±0.031.32±0.140.22±0.08138.725＜0.001 Nanog0.15±0.040.97±0.120.44±0.0774.455＜0.001

图6 LncRNA NNT-AS1，miR-582-5p，NCKAP1 作用对膀胱癌干细胞干性鉴定

2.8 LncRNA NNT-AS1 调控miR-582-5p/NCKAP1对Hippo-YAP/TAZ信号通路的影响 Western blot结果显示，sh-NNT-AS1+inh-582-5p 组细胞中NCKAP1，YAP，TAZ 蛋白表达灰度值较sh-NNT-AS1 组明显升高，差异有统计学意义（t=17.575，11.649，13.048，均P＜0.001）。sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1 组细胞中上述蛋白表达灰度值则较sh-NNT-AS1+inh-582-5p 组显著降低，差异有统计学意义（t=17.173，13.925，13.663，均P＜0.001），见图7 和表7。结果表明，LncRNA NNT-AS1 调控激活Hippo-YAP/TAZ 信号通路发挥作用可能是通过miR-582-5p/NCKAP1 分子轴来实现。

表7 LncRNA NNT-AS1，miR-582-5p，NCKAP1 作用对Hippo-YAP/TAZ 信号通路关键蛋白表达的影响（±s，n=3）

表7 LncRNA NNT-AS1，miR-582-5p，NCKAP1 作用对Hippo-YAP/TAZ 信号通路关键蛋白表达的影响（±s，n=3）

项目sh-NNT-AS1 组sh-NNT-AS1+inh-582-5p 组sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1 组F 值P 值NCKAP10.13±0.041.44±0.150.16±0.03201.324＜0.001 YAP0.42±0.071.29±0.110.25±0.09111.598＜0.001 TAZ0.35±0.051.41±0.160.30±0.04119.101＜0.001

图7 Western blot 检测Hippo-YAP/TAZ 信号通路关键蛋白表达

3 讨论

近年膀胱癌发病逐渐增多，转移、复发率高，临床诊治缺少有效的靶点和标志物，患者预后较差[11-12]。随着基因测序技术的发展，越来越多研究表明，非编码RNA 与肿瘤的发生发展关系密切，其中LncRNA 可参与细胞的生长、转移及血管新生和耐药等途径，调控肿瘤的恶性进展，为肿瘤研究及诊治提供了新的方向和思路[13-15]。膀胱癌的发展进程中亦发现LncRNA 足迹，如LncRNA MORT，LncRNA CCAT1，LncRNA-RMRP[16-18]等均报道与膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡等过程相关。LncRNA NNT-AS1 是近年新发现的LncRNA，现已在非小细胞肺癌[19]、胶质瘤细胞[10]中证实其扮演重要的原癌基因角色。然而LncRNA NNT-AS1在膀胱癌中的作用机制目前尚不明确，因此本研究基于体外细胞实验探究了其在膀胱癌中的表达作用机制。

本研究发现膀胱癌组织和细胞中lncRNA NNTAS1 均显著高表达，尤在T24 细胞中表达最高。相关研究发现LncRNA NNT-AS1 高表达于肺癌、胶质瘤以及胆管癌，促进了肿瘤的生长和转移[9-10,20]。本研究亦发现，抑制LncRNA NNT-AS1 表达能够抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制肿瘤干细胞干性。在调控机制上，LncRNA 常作为海绵分子，竞争性吸附miRNA，而miRNA 与其靶基因的3’非翻译区结合，可抑制靶基因的蛋白质翻译[21]。对LncRNA NNT-AS1 的功能机制研究发现，其通过调控miR-142-5p/SOX4 分子轴介导了胃癌细胞的增殖、迁移[22]；LncRNA NNT-AS1 调控miR-3666/E2F2 轴参与了肺癌细胞的恶性生长[23]。本研究通过数据库预测及验证探究发现，miR-582-5p 为LncRNA NNT-AS1 的靶基因，NCKAP1 为miR-582-5p 的靶基因，LncRNA NNT-AS1 可调控miR-582-5p/NCKAP1 轴来抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭及膀胱癌干细胞干性。ZHONG 等[24]研究表明，NCKAP1 通过增强肝细胞癌中Rb1/p53 的活化可改善患者预后，抑制细胞生长。CHEN 等[25]研究表明，慢性肾细胞癌中NCKAP1 表达下调可抑制癌细胞生长，是重要的预后生物标志物。本研究结果提示，调控LncRNANNT-AS1/miR-582-5p/NCKAP1 轴能够影响膀胱癌的恶性生物学行为，LncRNA NNT-AS1和NCKAP1 有望成为膀胱癌诊治的潜在标志物。

Hippo-YAP/TAZ 是一种高保守性的可抑制细胞生长的信号通路，近年研究证实其在肿瘤侵袭转移、上皮间质转化、化疗耐药、肿瘤免疫逃逸及肿瘤干细胞自我更新中发挥重要作用[26]。如QIAO 等[27]研究表明，乳腺癌中YY1 激活的LINC00673 可能通过调控miR-515-5p/MARK4 轴，抑制Hippo 信号通路，发挥致癌功能。WANG 等[28]研究表明，缺氧可诱导LncRNA GHET1 表达，导致Hippo/YAP信号通路过度激活，促进TNBC 的糖酵解及恶性进展。LIN 等[29]研究表明，LINC00857 通过与miR-486-5p 竞争性结合调节YAP1 表达，促进了卵巢癌细胞糖酵解及增殖、迁移。ZHU 等[30]研究发现，miR-582-5p 是可靶向非小细胞肺癌Hippo-YAP/TAZ 信号通路的肿瘤抑制因子。膀胱癌中LncRNA NNT-AS1 是否能够调控miR-582-5p/NCKAP1 轴，影响Hippo-YAP/TAZ 信号通路，进而发挥作用？为验证该猜想，本研究探究发现，抑制LncRNA NNT-AS1 表达后NCKAP1 及Hippo-YAP/TAZ 信号通路关键蛋白表达下调，LncRNA NNT-AS1 高表达可通过调控miR-582-5p/NCKAP1 轴来激活Hippo-YAP/TAZ 信号通路，参与膀胱癌的发生发展。然而肿瘤发生发展机制复杂且多样，本研究仅局限在体外细胞水平，LncRNA NNT-AS1 的调控作用和机制还需通过体内实验进一步探究。

综上所述，膀胱癌中LncRNA NNT-AS1 高表达可能通过调控miR-582-5p/NCKAP1 分子轴，激活Hippo-YAP/TAZ 信号通路，进而参与调控膀胱癌的发生发展。