ALKBH5调控GEFT的m6A修饰对胆管癌转移及EMT的实验研究

王希方，郑 伟，马东瑞，何 莉，孙晶莹，孙 杨，孟 莲，孙 超

（1．陕西省人民医院 a.肿瘤内科；b.肝胆外科；c.教学处；d.中心实验室；e.统计室，西安 710068；2．石河子大学医学院第一附属医院病理科，新疆石河子 832008）

胆管癌（cholangiocarcinoma，CCA）是肝脏第二大原发恶性肿瘤，约占肝脏原发恶性肿瘤的5%～30%，其在中国的发病率持续上升[1-3]。CCA发病时无突出的临床表现，因此初次诊断时多为终末期，目前迫切需要寻找到新的治疗方式[4]。上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）参与CCA 的转移和复发，CCA 细胞通过EMT 获得了更具侵袭性的表型[6]。因此，通过调节EMT 来抑制转移可能是治疗CCA 的一个有效策略。鸟嘌呤核苷酸交换因子T（guanine nucleotide exchange factor T，GEFT），也称为Rho 鸟嘌呤核苷酸交换因子25，参与癌细胞的增殖、迁移和侵袭等多种过程[7]。先前的研究表明，GEFT 在某些恶性肿瘤中作为潜在的致癌基因发挥作用，例如乳腺癌和横纹肌肉瘤[8-9]。此外，GEFT 的高表达可促进EMT 过程[10]。但GEFT 在CCA 进展和转移方面的潜在功能和途径尚不清楚。越来越多的证据表明，6-甲基腺苷（6-Methyladenosine，m6A）甲基化作为一种重要的转录后基因调控机制，参与了CCA的发病机制[11-12]。alkB 同源蛋白5（alkB homolog 5，ALKBH5）是一种m6A 去甲基化酶，参与m6A修饰的调节，并控制各种细胞过程。ALKBH5 介导的m6A 去甲基化通过影响RNA 代谢中的多种事件（例如mRNA 剪切、修饰和翻译等）来调节基因表达。m6A 去甲基化酶ALKBH5 主要是通过以m6A 依赖的方式对致癌基因或抑癌基因进行转录后调节，在多种人类恶性肿瘤中发挥关键作用。据报道，ALKBH5 调节肝内CCA 中程序性死亡配体-1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）的表达和肿瘤免疫环境[13]。然而，目前关于m6A参与CCA 发病机制的研究仍十分有限。本研究旨在探讨ALKBH5 是否通过调控GEFT 的m6A 修饰水平来影响CCA 的转移及EMT。

1 材料与方法

1.1 研究对象 人胆管上皮癌细胞系（HuCCT1）购自美国ATCC。HuCCT1 细胞培养在添加10g/dl胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的RPMI 1640培养液中于5% （v/v）CO2，37℃环境中培养。

1.2 仪器与试剂 RPMI 1640 培养液（货号：11875093）和FBS（货号：10100147）购自美国Gibco 公司；阴性对照shRNA 慢病毒（NC-sh）、ALKBH5 shRNA 慢病毒（ALKBH5-sh）、阴性对照过表达慢病毒（NC-LV）、ALKBH5 过表达慢病毒（ALKBH5-LV）和GEFT shRNA慢病毒（GEFT-sh）购自吉玛基因。四甲基偶氮唑盐（MTT，货号：M8180-1）和GEFT（货号：K110033P）一抗购自北京索莱宝科技有限公司。Transwell（8 μm 孔径，货号：3422）购自美国Corning 公司；Annexin V-FITC/PI 试剂盒（货号：C1062M），Trizol（货号：R0016），RIPA 裂解液（货号：P0013D）和BCA 蛋白测试盒（货号：P0012）购自碧云天生物技术研究所。引物购自生工生物。逆转录试剂盒（货号：RR047Q）和TB Green Premix Ex Taq II（货号：RR820B）购自日本Takara 公司；β-actin 一抗（货号：ab8227）和HRP 标记的二抗（货号：ab6721）购自英国Abcam 公司；ALKBH5（货号：80283）一抗购自美国Cell Signaling Technology 公司；PolyA mRNA 纯化试剂盒（货号：S1560S）购自美国New England Biolabs 公司；RNA 甲基化免疫共沉淀试剂盒（货号：Bes5203-2）购自广州伯信生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及分组处理：将HuCCT1 细胞分为control 组、NC-sh 组、ALKBH5-sh 组、NC-LV组、ALKBH5-LV 组、ALKBH5-LV+NC-sh 组和ALKBH5-LV+GEFT-sh 组。将对数生长期的HuCCT1 细胞以2×105个细胞/孔的密度接种于6孔板，当细胞达到60%融合时，使用Lipofectamine 2000 试剂进行转染。control 组细胞正常培养不进行转染处理，NC-sh 组细胞转染阴性对照shRNA慢病毒，ALKBH5-sh 组细胞转染ALKBH5 shRNA慢病毒，NC-LV 组细胞转染阴性对照过表达慢病毒，ALKBH5-LV 组细胞转染ALKBH5 过表达慢病毒，ALKBH5-LV+NC-sh 组细胞同时转染ALKBH5 过表达慢病毒和阴性对照shRNA 慢病毒，ALKBH5-LV+GEFT-sh 组细胞同时转染ALKBH5 过表达慢病毒和GEFT shRNA 慢病毒，转染时间为48 h。通过RT-qPCR 验证转染效率。

1.3.2 细胞增殖测定：HuCCT1 细胞经过转染后，以5×103个细胞/孔的密度接种于96 孔板中，并在37℃条件下培养48 h，加入MTT 继续培养孵育4 h，弃上清。加入DMSO，室温缓慢摇晃10 min，然后于酶标仪490 nm 处测量吸光度A值。

1.3.3 细胞凋亡测定：HuCCT1 细胞经过转染后，以1×105个细胞/孔的密度接种在6 孔板中并在37℃培养48 h，PBS 重悬细胞。取5×104个HuCCT1 细胞8 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入195 μl 结合缓冲液，再依次加入5 μl 的Annexin V-FITC 和10 μl 的PI，避光孵育5 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.4 细胞迁移和侵袭测定：HuCCT1 细胞经过转染后，取1×104个HuCCT1 细胞重悬于200 μl 无血清培养液中，然后添加到Transwell 上室。将800 μl含20g/dl FBS的培养液加入到下室。孵育48 h后，4g/dl 多聚甲醛固定HuCCT1 细胞30 min，1g/dl结晶紫染色15 min。显微镜下进行迁移细胞计数。侵袭实验中，预先使用50 μl 的Matrigel（250 μg/ml）包被上室，其他步骤与迁移实验相同。

1.3.5 RT-qPCR 检测mRNA表达水平：采用RT-qPCR检测HuCCT1 细胞中的ALKBH5，GEFT，B 淋巴细胞瘤-2 相关X 蛋白（Bcl2-associated X，Bax），B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2），基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2），基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 9，MMP-9），上皮型钙黏蛋白（E-cadherin），神经型钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的mRNA 表达水平。Trizol 提取各组细胞的总RNA，通过NanoDrop 2000 超微量分光光度计测定总RNA 的浓度和纯度，按照逆转录试剂盒进行逆转录反应。使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ在Bio-Rad CFX96 荧光定量PCR 仪上进行扩增。扩增条件如下：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃15 s，40 次循环。β-actin 作为内参，使用2-△△Ct法计算相对表达量，引物序列见表1。

1.3.6 Western blot 检测蛋白表达水平：采用Western blot 检测HuCCT1 细胞中的ALKBH5 和GEFT 的蛋白表达水平。RIPA 裂解HuCCT1 细胞提取总蛋白，通过BCA法测定总蛋白浓度，然后总蛋白（30 μg/泳道）上样，采用10g/dl SDS-PAGE 上进行电泳并转移到PVDF 膜上，5g/dl 脱脂牛奶封闭1 h，然后膜与ALKBH5（1∶3 000 稀释），GEFT（1：3000 稀释）和β-actin（1∶5 000 稀释）一抗4℃孵育过夜，再与HRP 标记的二抗（1∶5 000 稀释）室温孵育1 h，ECL 显影和凝胶成像。β-actin 作为内参。

1.3.7 甲基化RNA 免疫共沉淀结合qPCR 技术（MeRIP-qPCR）检测甲基化水平：采用MeRIPqPCR 检测HuCCT1 细胞中GEFT m6A 甲基化水平。Trizol 提取各组细胞的总RNA，通过PolyA mRNA 纯化试剂盒纯化总RNA。将m6A 抗体和IgG 的抗体分别添加到免疫共沉淀缓冲液中然后与蛋白质A/G 磁珠孵育1 h。将RNA 和磁珠-抗体复合物加入到免疫共沉淀缓冲液中4℃孵育过夜。使用洗脱缓冲液将结合的RNA 进行洗脱，然后用苯酚-氯仿提取纯化，并进行qPCR 分析。GEFT m6A 甲基化位点引物序列如下：F：5’-GTAC GCGGCCTAGAACTGCG-3’，R：5’-GTTTGCGGA CAGTTCGTACAG-3’。β-actin 作为内参。

1.4 统计学分析 使用GraphPad Prism 8.0 软件对数据进行统计分析和作图。细胞实验中每组设置6个复孔。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用LSD 检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ALKBH5 和GEFT 对HuCCT1 细胞增殖的调控作用 见表2和图1。与control组和NC-sh组比较，ALKBH5-sh 组 的ALKBH5 mRNA，ALKBH5 蛋白，GEFT mRNA 和GEFT 蛋白水平均降低，差异具有统计学意义（F=684.705，756.058，339.612，662.205，均P＜0.001）。与control 组和NC-LV 组比较，ALKBH5-LV 组的ALKBH5 mRNA，ALKBH5蛋白，GEFT mRNA 和GEFT 蛋白水平均升高，差异具有统计学意义（F=720.275，451.295，510.924，42.421，均P＜0.001）。与ALKBH5-LV+NC-sh 组比较，ALKBH5-LV+GEFT-sh 组的GEFT mRNA 和GEFT蛋白水平均降低，差异具有统计学意义（t=16.215，9.454，均P＜0.001）。各组细胞的相对细胞活力差异有统计学意义（F=223.258，P＜0.001）。与control 组（100.00%±3.90%） 和NC-sh 组（100.57%±3.84%）比较，ALKBH5-sh 组（54.31%±5.64%）的相对细胞活力降低，差异具有统计学意义（F=205.415，均P＜0.001）。与control 组（100.00%±3.90%）和NC-LV组（100.54%±3.31%）比较，ALKBH5-LV组（135.12%±4.86%）的相对细胞活力升高，差异具有统计学意义（F=146.451，均P＜0.001）。与ALKBH5-LV+NC-sh组（129.29%±5.35%） 比较，ALKBH5-LV+GEFT-sh组（70.67%±5.72%）的相对细胞活力降低，差异具有统计学意义（t=18.333,，均P＜0.001）。

图1 Western blot 检测各组HuCCT1 细胞中ALKBH5 和GEFT 蛋白表达水平

表2 各组HuCCT1 细胞中ALKBH5 和GEFT 的mRNA 和蛋白表达水平（±s）

表2 各组HuCCT1 细胞中ALKBH5 和GEFT 的mRNA 和蛋白表达水平（±s）

项目control 组NC-sh 组ALKBH5-sh 组NC-LV 组ALKBH5-LV 组ALKBH5+NCsh 组ALKBH5+GEFTsh 组F 值P 值ALKBH5 mRNA1.00±0.04 0.98±0.05 0.25±0.02 1.03±0.046.92±0.547.34±0.726.98±0.84315.576＜0.001 GEFT mRNA1.00±0.05 1.01±0.08 0.31±0.02 0.99±0.024.46±0.374.64±0.590.68±0.03283.760＜0.001 ALKBH5 蛋白1.00±0.05 1.02±0.03 0.30±0.02 1.01±0.044.09±0.353.76±0.584.29±0.78117.890＜0.001 GEFT 蛋白1.00±0.04 1.02±0.04 0.31±0.03 1.02±0.072.82±0.672.95±0.600.63±0.0656.405＜0.001

2.2 ALKBH5 和GEFT 对HuCCT1细胞凋亡的调控作用 见表3 和图2。与Control 组和NC-sh 组比较，ALKBH5-sh 组的细胞凋亡率和Bax mRNA水平升高，Bcl-2 mRNA 水平降低，差异具有统计学意义（F=1995.868，340.917，321.576，均P＜0.001）。与control 组和NC-LV 组比较，ALKBH5-LV 组的细胞凋亡率和Bax mRNA 水平降低，Bcl-2 mRNA 水平升高，差异具有统计学意义（F=71.031，225.970，217.678，均P＜0.001）。与ALKBH5-LV+NC-sh 组比较，ALKBH5-LV+GEFTsh 组的细胞凋亡率和Bax mRNA 水平升高，Bcl-2 mRNA（0.69±0.09）水平降低，差异具有统计学意义（t=9.571，30.872，38.331，均P＜0.001）。

图2 流式细胞仪检测HuCCT1 细胞凋亡情况

表3 各组HuCCT1 细胞中细胞凋亡相关指标表达比较（±s）

表3 各组HuCCT1 细胞中细胞凋亡相关指标表达比较（±s）

项目control 组 NC-sh 组 ALKBH5-sh 组 NC-LV 组 ALKBH5-LV 组 ALKBH5+NC-sh 组 ALKBH5+GEFT-sh 组F 值P 值凋亡率（%） 5.05±0.48 4.82±0.40 27.88±1.10 5.16±0.58 2.51±0.02 2.50±0.03 6.77±1.091 085.899＜0.001 Bax mRNA 1.00±0.04 0.98±0.07 5.34±0.57 0.97±0.05 0.45±0.05 0.46±0.04 1.34±0.06 361.734＜0.001 Bcl-2 mRNA 1.00±0.05 1.04±0.04 0.48±0.03 1.03±0.08 4.22±0.52 4.39±0.22 0.69±0.10 293.694＜0.001

2.3 ALKBH5 和GEFT 对HuCCT1 细胞迁移和侵袭的调控作用 见表4 和图3。与control 组和NC-sh组比较，ALKBH5-sh 组的迁移和侵袭细胞数量降低，差异具有统计学意义（F=76.763，43.347，均P＜0.001）。与control 组和NC-LV 组比较，ALKBH5-LV 组的迁移和侵袭细胞数量升高，差异具有统计学意义（F=27.888，32.804，均P＜0.001）。与ALKBH5-LV+NC-sh 组比较，ALKBH5-LV+GEFT-sh 组的迁移和侵袭细胞数量降低，差异具有统计学意义（t=7.704，7.175，均P＜0.001）。与control 组和NC-sh 组比较，ALKBH5-sh 组的MMP2 和MMP9 mRNA 水平均降低，差异具有统计学意义（F=757.446，326.983，均P＜0.001）。与control 组和NC-LV 组比较，ALKBH5-LV 组的MMP2 和MMP9mRNA 水平均升高，差异具有统计学意义（F=283.083，467.846，均P＜0.001）。与ALKBH5-LV+NC-sh 组比较，ALKBH5-LV+GEFTsh 组MMP2 和MMP9 的mRNA 水平均降低，差异具有统计学意义（t=16.255，23.276，均P＜0.001）。

图3 ALKBH5 和GEFT 对HuCCT1 细胞迁移和侵袭的影响（×400 倍）

表4 各组HuCCT1 细胞中细胞迁移和侵袭数量及相关指标表达比较（±s）

表4 各组HuCCT1 细胞中细胞迁移和侵袭数量及相关指标表达比较（±s）

项目Control 组NC-sh 组 ALKBH5-sh 组 NC-LV 组 ALKBH5-LV 组ALKBH5+NC-sh 组ALKBH5+GEFT-sh 组F 值P 值迁移细胞数 59.53±7.18 66.09±5.36 29.33±3.15 64.94±4.52 84.76±6.48 82.33±8.1049.64±6.51355.181＜0.001侵袭细胞数 49.59±6.73 53.53±7.28 24.99±1.07 45.66±5.40 70.34±4.70 73.58±9.8340.05±5.8658.628＜0.001 MMP2 mRNA 1.00±0.05 0.99±0.030.36±0.02 1.01±0.03 2.00±0.13 1.94±0.150.81±0.0842.685＜0.001 MMP9 mRNA 1.01±0.05 0.98±0.060.33±0.04 1.01±0.03 2.40±0.15 2.30±0.140.78±0.09459.758＜0.001

2.4 ALKBH5 和GEFT 对HuCCT1 细胞EMT 的调控作用 见表5。与control 组和NC-sh 组比较，ALKBH5-sh 组的E-cadherin mRNA 水平升高，N-cadherin 和Vimentin mRNA 水平降低，差异具有统计学意义（F=201.298，504.058，317.305，均P＜0.001）。与control 组和NC-LV 组比较，ALKBH5-LV 组的E-cadherin mRNA 水平降低，Ncadherin 和Vimentin 水平升高，差异具有统计学意义（F=617.990，175.551，215.997，均P＜0.001）。与ALKBH5-LV+NC-sh 组比较，ALKBH5-LV+GEFTsh 组的E-cadherin mRNA 水平升高，N-cadherin 和Vimentin mRNA 水平降低，差异具有统计学意义（t=16.598，77.872，16.728，均P＜0.001）。

表5 各组HuCCT1 细胞中E-cadherin，N-cadherin 和Vimentin 的mRNA 表达水平（±s）

表5 各组HuCCT1 细胞中E-cadherin，N-cadherin 和Vimentin 的mRNA 表达水平（±s）

项目Control 组NC-sh 组ALKBH5-sh 组 NC-LV 组 ALKBH5-LV 组ALKBH5+NC-sh 组ALKBH5+GEFT-sh 组F 值P 值E-cadherin1.00±0.021.02±0.055.29±0.741.01±0.030.43±0.050.41±0.011.40±0.15213.718＜0.001 N-cadherin1.00±0.030.98±0.050.37±0.031.00±0.094.72±0.684.49±0.110.69±0.06298.279＜0.001 Vimentin1.00±0.070.97±0.040.38±0.030.98±0.063.39±0.393.58±0.410.69±0.10216.860＜0.001

2.5 ALKBH5 对HuCCT1 细胞GEFT m6A 甲基化修饰的影响 各组细胞的GEFT m6A 甲基化水平差异具有统计学意义（F=232.230，P＜0.001）。与control 组（1.00±0.032）和NC-sh 组（1.02±0.028）比较，ALKBH5-sh 组（3.42±0.440）的GEFT m6A甲基化水平升高，差异具有统计学意义（F=177.365，均P＜0.001）。与control 组（1.00±0.032）和NC-LV组（0.99±0.055）比较，ALKBH5-LV组（0.41±0.033）的GEFT m6A 甲基化水平降低，差异具有统计学意义（F=399.929，均P＜0.001）。

3 讨论

m6A 甲基化作为一种重要的转录后基因调控机制，参与了CCA 的发病机制[11-12]。m6A 甲基化失调可引起RNA 代谢缺陷[14]。ALKBH5 是一种m6A去甲基化酶，负责将甲基从腺嘌呤上去除，介导RNA 的去甲基化修饰过程。ALKBH5 介导的基因转录后调控对于正常生理和病理生理事件都至关重要。研究表明，ALKBH5 可以调节癌症的表观转录组，引起细胞增殖、存活、侵袭和转移、药物敏感性、癌症干细胞状态和癌症免疫的改变[15]。在人肝内CCA 细胞系中，ALKBH5 去除了PD-L1 mRNA 的3’UTR 中的m6A 修饰，并以YTH 结构域N6-甲基腺嘌呤RNA 结合蛋白2 依赖性方式减少PD-L1 降解，从而促进了PD-L1 的表达，抑制了T 细胞的细胞毒性并介导肝内CCA 细胞的免疫逃逸[13]。本研究表明，下调ALKBH5 抑制了HuCCT1 细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导了细胞凋亡，升高了促凋亡基因Bax 的mRNA 水平，降低了抗凋亡基因Bcl-2 的mRNA 水平，降低了癌细胞转移相关基因MMP2和MMP9 的mRNA 水平。而上调ALKBH5 则效果相反。这些结果提示ALKBH5 在CCA 中属于一种致癌基因，其高表达增加了CCA 细胞的活性和转移能力。

m6A 修饰可能为CCA 临床治疗提供新的途径，但目前关于m6A 参与CCA 发病机制的研究仍十分有限，尚无与CCA 细胞中GEFT m6A 修饰有关的研究。近年来临床研究发现，GEFT 表达与肿瘤细胞的病理分级和预后相关。GEFT 在横纹肌肉瘤中表达上调，下调GEFT 的表达可抑制横纹肌肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移，并诱导细胞凋亡[8]。GEFT的过表达可提高横纹肌肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，抑制细胞凋亡[10]。与正常肠黏膜相比，结直肠癌组织中GEFT 的表达增加，并且GEFT 高表达的结直肠癌患者预后较差，GEFT 的高表达与CRC 中的淋巴结转移相关[10]。GEFT 在结肠癌等许多恶性肿瘤中均有异常表达[16]，GEFT 的表达与肿瘤细胞的病理分级和预后相关[17]。本研究结果显示，下调ALKBH5 表达水平抑制了HuCCT1 细胞中GEFT 的表达，上调ALKBH5 表达水平则促进了GEFT 的表达。进一步研究证实，下调GEFT 未影响HuCCT1 细胞中ALKBH5 的表达，但逆转了ALKBH5 对HuCCT1 细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。这些结果证实ALKBH5 可能通过调控GEFT 来影响CCA 的发生发展。

抑制EMT 是抑制肿瘤转移的关键。EMT 过程中，上皮细胞失去细胞极性，上皮细胞骨架发生重组，失去与基底膜的连接，同时癌细胞分泌大量MMP-2 和MMP-9 降解细胞外基质[18]，导致癌细胞获得了更高的迁移和侵袭能力[19]。在CCA 中EMT参与转移和复发，因此，通过调节EMT 来抑制肿瘤转移可能是治疗CCA 的有效策略。本研究结果显示，下调ALKBH5 表达水平抑制了HuCCT1 细胞的EMT 过程，而上调ALKBH5 表达水平则促进了EMT 过程。进一步研究证实，下调GEFT 逆转了ALKBH5 对HuCCT1 细胞EMT 的影响。这些结果证实ALKBH5 通过调控GEFT 来影响CCA 的EMT 过程。其他文献报道，GEFT 上调了横纹肌肉瘤细胞中N-cadherin，Snail，Slug，Twist，Zeb1 和Zeb2 的表达水平，并降低了E-cadherin 的表达水平，GEFT 通过激活Rac1/Cdc42 PAK 信号通路诱导的EMT来加速横纹肌肉瘤细胞的肿瘤发生和转移[10]。ALKBH5 促进乳腺浸润性导管癌侵袭和转移可能与增强EMT 和血管生成有关[20]，亦支持本研究结果。

m6A 甲基化参与调节CCA 的EMT 过程[11,21]。其他文献报道，横纹肌肉瘤细胞中GEFT 基因启动子甲基化水平低于正常横纹肌组织[10]。RNA m6A 甲基化抑制了胶质母细胞瘤中的EMT 过程，ALKBH5通过降低RNA m6A 甲基化水平在体内增强了胶质母细胞瘤的生长并增强了胶质瘤的EMT 过程[22]。本研究结果显示，下调ALKBH5 表达水平升高了HuCCT1 细胞GEFT m6A 甲基化水平，而上调ALKBH5 表达水平则降低了GEFT m6A 甲基化水平。这些结果说明ALKBH5 可能通过调控GEFT m6A 甲基化修饰来影响CCA 的转移及EMT。

综上所述，本研究表明ALKBH5 和GEFT 均促进CCA 细胞的生长和转移，ALKBH5 可能通过调控GEFT m6A 甲基化修饰来影响CCA 的转移及EMT过程。本研究创新性地剖析ALKBH5 参与CCA 的EMT 发生的具体机制，与GEFT m6A 甲基化修饰相结合，进一步深入探索这两者之间的关系，为深入探究CCA 发生发展的分子机制打开了新视野。