磷霉素联合多黏菌素B对碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌的体外抗菌活性分析

刘泽世，殷 鉴，雷 静，张 雪，张彦平，耿 燕，蔡 艳

（西安交通大学第二附属医院 a.检验科；b.药学部，西安 710004）

美国疾病控制与预防中心(Center for Disease Control and Prevention,CDC)表示，碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（carbapenem-resistantEnterobacterales,CRE）被认为是紧迫的威胁[1]。在中国，肠杆菌目细菌对碳青霉烯类耐药率也达到64.1%[2]。CRE 一旦引发感染往往导致患者治疗失败、死亡率高[3-4]，造成患者疾病负担重。有研究表明，在我国仅有11% CRE 没有产生碳青霉烯酶[5]，而针对绝大多数产碳青霉烯酶的菌株，可用于治疗的药物极少。目前我国临床上主要使用的治疗药物无外乎替加环素、黏菌素以及头孢他啶/阿维巴坦。但是随着碳青霉烯酶不同酶型种类的增加，头孢他啶/阿维巴坦体外抗菌活性作用效果已不尽如人意[6-7]。在初始抗生素的治疗阶段，联合用药往往可以提高患者生存率[8]，若体外两种抗生素的联合药敏实验结果显示为协同作用或相加作用，则可预测该药物组合将具有较强的抗菌活性。广谱抗生素磷霉素是一类小分子抗生素，通过抑制细胞壁合成从而杀灭细菌，临床常用于治疗多种革兰阴性菌或多重耐药菌引发的感染[9]。多黏菌素是一种多肽类的抗生素，通过作用于细胞膜脂多糖所带负电的脂质从而破坏细胞膜的完整性，发挥其杀菌作用。随着限制级药物使用频率增多，碳青霉烯类耐药菌检出日益增多，多黏菌素因其耐药率低，杀菌效果明显被多个专家共识推荐为治疗选择之一[10]。因此，本研究拟分析多黏菌素B 联合磷霉素，并进行微量棋盘稀释法来判定其联合效应，进一步评价磷霉素联合多黏菌素B用药方案的可行性，为临床合理使用抗生素提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集西安交通大学第二附属医院2020～2022 年培养阳性、非重复CRE 78 株，包括碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（carbapenemresistantKlebsiella pneumonia，CRKP ）46 株，碳青霉烯类耐药大肠埃希菌（carbapenem-sensitiveEscherichia coli，CREC） 32 株；另选择同一时期碳青霉烯类敏感肠杆菌目细菌(carbapenem-sensitiveEnterobacterales，CSE) 132 株（均未携带碳青霉烯酶耐药基因），其中碳青霉烯类敏感大肠埃希菌（carbapenem-sensitiveEscherichia coli，CSEC）72株、碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌（carbapenem-sensitiveKlebsiella pneumonia，CSKP）60 株作为对照。本研究通过我院伦理委员会批准（编号：2022030）。

1.2 仪器与试剂 VITEK-Ⅱ-COMPACT 鉴定仪（法国BioMérieux 公司）；血平板、麦康凯平板（郑州安图公司）；磷霉素药敏板，多黏菌素B 药敏板（温州康泰生物科技有限公司，批号：DZ1181，DZ1182），磷霉素和多黏菌素联合药敏板（温州康泰生物科技有限公司，批号：DZ1191）。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株鉴定：复苏我院2020～2023 年12 月22 日培养阳性、碳青霉烯类耐药和非产碳青霉烯酶的肠杆菌目细菌非重复性菌株210 株，三区划线接种于血琼脂平板上，放置35±2℃环境下培养18～24h，再次经VITEK-Ⅱ-COMPACT 鉴定仪鉴定均为肠杆菌目细菌，且78 株CRE 均对碳青霉烯类药物耐药。

1.3.2 肉汤微量稀释法药敏试验：采用美国临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）推荐的肉汤微量稀释法[11]分别测定待检菌株对磷霉素和多黏菌素B 的敏感性，磷霉素的浓度测定范围为0.064～256 μg/ml，多黏菌素B 的浓度测定范围为0.25～16 μg/ml。接种环挑取经18～24 h 孵育后的新鲜纯菌落于无菌生理盐水中，调制成相当于0.5 麦氏浊度的菌悬液（务必于20 min 内使用）；吸取0.5 麦氏浊度菌悬液，加入到药敏接种培养液中，菌液和培养液的比例为1∶200，充分混匀，每孔加入100 μl 稀释后的菌液；35±2℃大气环境孵育，孵育16～20 h，通过浊度判断各个孔内细菌的生长情况，然后读取相应的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)值。参照 CLSI 2022 年的标准[11]判读药敏结果（多黏菌素B 耐药: MIC≥4 μg/ml，磷霉素耐药：MIC ≥256 μg/ml）。

1.3.3 微量棋盘稀释法药敏试验：操作步骤同1.3.2肉汤微量稀释法药敏试验。在阳性对照生长良好的前提下，通过浊度判断各个孔内细菌的生长情况，由低浓度向高浓度观察，能抑制细菌生长的最低药物浓度即为MIC。出现跳孔现象时，往前跳一孔以阅读该药高浓度结果为MIC，出现连续跳孔时，需重复试验。

1.3.4 部分抑菌浓度指数计算与判读标准：部分抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index,FIC）=（联合时A 药的MIC/单用时A 药的MIC）+（联合时B 药的MIC/单用时B 药的MIC）。FIC ≤0.5：协同作用，提示两种药物联合后的抗菌活性显著大于各单药；0.5＜FIC ≤1：相加作用，提示两种药物联合后的抗菌活性较各单药稍有增加；1＜FIC ≤2：无关作用，提示两种抗生素的活性均不受另一种药物的影响；FIC＞2：拮抗作用，提示一种抗生素的活性被另一种抗生素削弱[12]。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行统计分析。药物单用与药物联用MIC 值比较采用t检验，计数资料采用χ2检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 磷霉素和多黏菌素B 单药对CRE 和CSE 的体外抗菌活性 见表1。78 株CRE 中，28 株对磷霉素耐药，总耐药率为35.90%（28/78）；其中6 株同时还对多黏菌素B 耐药，总耐药率为7.69%(6/78)。132 株CSE 中，18 株仅对磷霉素耐药，总耐药率为13.64%；未检测到对多黏菌素B 耐药。与CSE菌株相比，CRE 对磷霉素和多黏菌素B 的总耐药率差异有统计学意义（χ2=15.37，P＜0.05）。单用磷霉素时，CREC 和CRKP 对磷霉素的耐药率（37.50%和34.78%）与CSEC 和CSKP 的耐药率（9.72%和18.33%）之间差异有统计学意义（χ2=11.00，20.24，均P＜0.05）。此外，2 株CREC 和4 株CRKP 同时对磷霉素和多黏菌素B 的耐药率（6.25%和8.70%）与CSEC 和CSKP（均为0）之间差异具有统计学意义。对多黏菌素B 和磷霉素敏感的肠杆菌目细菌的MIC 总体分布见表2。

表1 78 株CRE 和132 株CSE 对磷霉素和多黏菌素B 体外活性[n(%)]

表2 磷霉素和多黏菌素B 敏感的肠杆菌目细菌MIC 分布情况比较

2.2 磷霉素、多黏菌素B 单用与联合应用后MIC值比较 见表3。磷霉素在单用时的MIC 值与两药联合后的MIC 值相比，差异具有统计学意义（t=4.509，P=0.001），联合使用后MIC 值显著降低。而多黏菌素B 单用和联用的MIC 之间差异无统计学意义（t=7.621，P=0.419），联合用药无明显差异。

表3 磷霉素联合多黏菌素B 对78 株CRE 的体外抗菌活性对比

2.3 磷霉素联合多黏菌素B 的部分抑菌浓度（fractional inhibitory concentration,FIC）构成比 见表4。在磷霉素与多黏菌素B 的联合药敏中，CREC 6株表现为协同作用，占18.75%（6/32）；22 株为相加作用，占68.75%（22/32）；4 株为无关作用，占12.50%（4/32），CREC 在联合药敏中主要表现为相加作用。在磷霉素与多黏菌素B 的联合药敏中，CRKP 29 株为协同作用，占63.04%（29/46）；12株为相加作用，占26.09%（12/46）；5 株为无关作用，占10.87%（5/46），CRKP 在联合药敏中主要表现为协同作用。

表4 磷霉素联合多黏菌素B 的FIC 值构成比[n(%)]

3 讨论

CRE 在全球的迅速传播导致患者治疗失败、死亡率高，并且可使用的治疗药物有限，对临床抗感染治疗以及预防控制带来严峻挑战[13]。而且在WHO 组织的新抗生素研发优先级列表中，CRE 也被列为最优先等级[14]。基于CRE 的传播速度，耐药增长程度，有限的治疗药物选择以及显著的发病率和死亡率[15-16]，以及新的抗生素又未能在短期内被快速地研发出来，CRE 的抗感染治疗将变得非常棘手。虽然目前CRE 对替加环素、多黏菌素和头孢他啶/阿维巴坦敏感性较好，但已有报道对上述三类药物耐药的肠杆菌目细菌[17-18]，CRE 一旦出现，无疑对医疗卫生和患者安全构成重大威胁。CRE 感染治疗面临的困境急需实验室开展联合药敏试验，体外联合药敏试验证实两药呈协同或相加作用的联合，能有效改善CRE 感染患者的病死率[19]。

根据碳青霉烯类耐药革兰阴性菌联合药敏试验及报告专家共识，对CRE 菌株建议以替加环素、多黏菌素和头孢他啶/阿维巴坦为基础，联合氨基糖苷类、磷霉素类等联合进行药敏试验[20]。多黏菌素B 是一类浓度依赖性药物，主要成分为多黏菌素B1，B2，B3 和异亮氨酸-B1，可以破坏革兰阴性细菌外膜从而实现杀菌活性[21-22]。磷霉素作为一类磷酸类抗生素，在阻断肽聚糖合成后通过渗透酶向细菌内部进行转运，可以与革兰阳性菌和革兰阴性菌形成N-乙酰基尿酸从而干扰细菌细胞壁的合成，是广谱抗生素且与其他抗生素无交叉耐药现象。本研究显示，CRE 菌株对磷霉素和多黏菌素B 单药时的总耐药率分别为35.90%和7.69%。磷霉素的耐药率与国内的其他研究结果相似[23]；多黏菌素B的耐药率略高于肖晓等[17]的研究，而低于黄家铭等[24]的研究。CRE 对磷霉素的耐药率较高可能是由于编码GlpT 和UhpT 的膜转运体结构发生基因突变导致ptsI 和cyaA 基因表达下调，与细菌细胞壁相关的abrp 基因也同时发生突变，上述因素会改变细菌细胞壁的通透性，影响细菌对磷霉素的摄取，导致磷霉素耐药[25-26]。

有文献报道磷霉素的应用已不仅限于尿路感染，而是逐渐应用于各类感染的治疗，诸如肺炎等[27-28]。磷霉素对肠杆菌目细菌具有良好的杀菌作用，但单独使用磷霉素时，细菌对磷霉素会产生耐药性导致治疗的失败。临床分离出CRE 后，常使用两种或三种药物联合治疗，不同的药物组合对CRE 菌株具有不同的抑菌或杀菌活性。本研究发现，当磷霉素与多黏菌素B 联合应用后，磷霉素的MIC 值显著降低，且多黏菌素B 联合磷霉素在体外对 CREC 主要表现为相加作用，对CRKP 主要表现为协同作用，与其他文献报道结果基本相符[29]。但体外药物敏感性试验与体内药物作用、代谢存在一定差异，同时患者的一般情况、清蛋白含量等都会影响药物联合使用的效果[30]。因此，本研究仅以体外的数据以期为临床提供多黏菌素B 和磷霉素联合用药的依据，为CRE 的治疗提供支持。

综上所述，多黏菌素B 联合黏菌素对CRE 有着较好的体外抗菌活性，磷霉素和多黏菌素B 联合使用或许可以降低其日益升高的耐药率。此外，多黏菌素B 联合磷霉素可能成为一种治疗CRE 新的治疗策略，在临床治疗方面可以进一步应用。