慢性肾病Ⅲ～Ⅴ期患者血清Klotho，OTA和Bcl-3表达水平与疾病预后的相关性研究

宋 强，李永钢（内蒙古包钢医院检验科，内蒙古包头 014010）

慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)可发展为终末期肾病，需肾脏替代治疗[1-2]。虽然肾小球滤过率能反映CKD 的疾病程度，但贫血、脑卒中等疾病可降低肾小球滤过率，影响评估准确性[3]。Klotho 蛋白是参与尿磷酸盐排泄过程的蛋白[4]。FREUNDLICH 等[5]研究发现，CKD 患者血清中Klotho 水平下降，有助于CKD 的早期诊断。赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是由青霉属和曲霉属菌产生的次级代谢物，具有肝肾毒性、致畸和免疫毒性[6]。研究发现，CKD 患者血清OTA 水平升高，具有促进凝血、抑制免疫等作用，促进CKD疾病进展[7-8]。B 细胞淋巴瘤因子3(B-cell lymphoma factor 3，Bcl-3)是IκB 家族的成员[9]。BARINOTTI等[10]发现，CKD 患者血清Bcl-3 表达升高，与肾纤维化程度有关，是反映CKD 疾病进展的血清标志物。目前CKD Ⅲ～Ⅴ期患者血清Klotho，OTA 和Bcl-3 表达的临床意义尚不清楚。本研究通过研究CKD Ⅲ～Ⅴ期患者血清Klotho，OTA 和Bcl-3 表达与肾功能及预后的关系，为临床诊治提供参考价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象 选取内蒙古包钢医院自2018 年1月～2019 年1 月期间收治的原发性CKD Ⅲ～Ⅴ期患者118 例为研究对象。纳入标准：①CKD 的诊断符合2002 年美国国家肾脏基金会制定的K/DOQI（Kidney Disease Outcome Quality Initiative）指南中的标准[11]；②年龄≥18 岁，CKD 病史＞6 个月，估计肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR）＜60ml/min；③临床病历资料完整；④患者无精神障碍性疾病，能够配合相关检查及随访。排除标准：①继发性肾病，如糖尿病肾病、高血压肾病、狼疮性肾炎等；②eGFR ≤5 ml/min，已开始透析的CKD 患者或预计短期内（≤3 个月）将进行透析治疗；③伴有自身免疫性疾病，糖皮质激素用药史或长期服用免疫抑制剂史等；④并发急性肾损伤、急性肾衰竭等疾病；⑤伴有其它肾脏疾病，如多囊肾、孤立肾等。CKD 患者病程2～13年，其中男性78 例，女性40 例；年龄45～68（58.18±3.63）岁；体质量指数（body mass index,BMI）22.27±2.30 kg/m2；参考K/DOQI 中CKD 诊断标准[11]：CKD Ⅲ期51 例，CKD Ⅳ期47 例，CKDⅤ期20 例。以同期我院健康查体的健康者60 例为对照组，其中男性37 例，女性23 例；年龄43～67（57.74±2.30）岁；BMI 22.41±2.29 kg/m2。两组在性别、年龄、体质量指数之间差异无统计学意义(均P＞0.05)。患者对本研究知情同意并签署知情同意书，本研究已获得伦理委员会批准通过。

1.2 仪器与试剂 人Klotho ELISA 试剂盒（上海梵态生物公司，货号FT-P31156R）。OTAELISA 试剂盒（上海研域生物公司，货号398637）。人Bcl-3 ELISA 试剂盒（上海臻科生物公司）。采用赛默飞 Varioskan LUX 酶标仪进行测定。

1.3 方法

1.3.1 血清Klotho，OTA，Bcl-3 水平检测：留取CKD 组患者治疗前及对照组清晨空腹静脉血5ml，3 000 r/min 离心10min，取血清于-20℃保存待用。采用酶联免疫吸附实验（双抗体夹心法）检测血清Klotho，OTA 和Bcl-3 水平。实验步骤按说明书进行，酶标仪检测各孔A450nm值，并根据标准品浓度的A值，计算每孔样品的浓度值。以血清Klotho，OTA 和Bcl-3 水平的均值2.54 mg/L，2.11 mg/L 和81.25 pmol/L为临界值，分为Klotho高表达组（n=60）和低表达组（n=58），OTA 高表达组（n=59）和低表达组（n=59），Bcl-3 高表达组（n=60）和低表达组（n=58）。

1.3.2 观察指标：收集所有研究对象性别、年龄、体质量指数（body mass index,BMI）、高血压史等一般临床资料，收集患者入院后第一天24 h 尿蛋白量、血红蛋白、清蛋白、总胆固醇、三酰甘油、血肌酐、尿素氮、血尿酸和血磷等实验室检查指标。应用肾脏病饮食改良研究公式(the modification of diet in renal disease equation,MDRD)计算eGFR=186×（Scr/88.4）-1.154×年龄-0.203×0742（女性）。

1.3.3 随访：以入组时间为起点，对所有CKD 患者进行随访，每三个月随访一次，以门诊或电话方式进行随访，随访内容为患者需要肾脏替代治疗或死亡，记录肾脏存活情况，随访截止时间为2022年3 月30 日。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析。符合正态性分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，三组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。计数资料以率（%）表示，组间比较采用卡方检验。相关性分析采用Pearson相关性分析。用Kaplan-Meier 生存分析（Log-Rank检验）血清Klotho，OTA和Bcl-3水平对CKD Ⅲ～Ⅴ期患者肾脏存活率的影响。单因素及多因素COX回归分析影响CKD Ⅲ～Ⅴ期患者肾脏结局事件发生的因素。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般资料及血清Klotho，OTA 和Bcl 3 水平比较 见表1。CKD 组高血压史、血肌酐、尿素氮、血尿酸、血磷、24h 尿蛋白量、OTA 及Bcl-3高于对照组，而血红蛋白、清蛋白、eGFR，Klotho低于对照组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 各组一般资料及血清Klotho，OTA，Bcl-3水平比较（±s）

表1 各组一般资料及血清Klotho，OTA，Bcl-3水平比较（±s）

类别对照组（n=60）CKD 组（n=118）t/χ2P高血压史[n(%)]12（20.00） 45（38.14） 6.010 0.014血肌酐（μmol/L） 72.14±10.55 389.74±22.98 101.641 0.000尿素氮（mmol/L）5.19±0.92 14.46±1.02 59.197 0.000 eGFR（ml/min/1.73m2） 98.89±14.62 33.17±10.82 33.901 0.000总胆固醇（mmol/L）4.68±0.824.72±0.930.282 0.778三酰甘油（mmol/L）1.53±0.621.58±0.830.412 0.681清蛋白（g/L）48.25±1.54 39.25±1.39 39.262 0.000 24h 尿蛋白量（g/24h） 0.81±0.075.19±0.8639.330 0.000血红蛋白（g/L）143.27±9.37 114.08±9.72 19.818 0.000血尿酸（ng/L）233.76±22.37 443.27±25.37 54.141 0.000血磷（mmol/L）1.10±0.381.42±0.424.958 0.000 Klotho（mg/L）8.24±1.302.54±0.3943.996 0.000 OTA（mg/L）0.40±0.132.11±0.4032.111 0.000 Bcl-3（pmol/L）48.14±10.28 81.25±13.67 16.526 0.000

2.2 不同CKD 分期患者血清Klotho，OTA 和Bcl-3水平比较 见表2。不同CKD 分期患者血清Klotho，OTA 和Bcl-3 比较，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。CKD 分期越高，血清Klotho 越低，血清OTA，Bcl-3 越高。CKD Ⅴ期患者血清Klotho，OTA 和Bcl-3 水平明显高于CKD Ⅳ期和CKD Ⅲ期患者，差异均有统计学意义（q=20.147,28.709,9.433,13.920; 11.287,15.545,均P=0.000）。CKD Ⅳ期患者血清Klotho,OTA 和Bcl-3 水平明显高于CKD Ⅲ期患者，差异具有统计学意义（q=10.858,5.709,5.381,均P=0.000）。

表2 不同CKD 分期患者血清Klotho，OTA，Bcl 3 水平比较（±s）

项目CKD Ⅲ期（n=51）CKD Ⅳ期（n=47）CKD Ⅴ期（n=20）FP Klotho（mg/L）3.13±0.372.53±0.411.06±0.37206.0710.000 OTA（mg/L）1.80±0.382.13±0.412.85±0.4548.5440.000 Bcl-3（pmol/L）71.49±10.6180.90±12.66106.96±14.8760.4460.000

2.3 血清Klotho，OTA，Bcl 3 与肾功能指标的相关性 见表3。CKD 组患者中，血清Klotho 与eGFR 呈显著正相关（r=0.627），血清OTA，Bcl-3与eGFR 呈显著负相关（r=-0.537，-0.489，均P＜0.05）。血清Klotho 表达与OTA，Bcl-3 表达呈显著负相关（r=-0.689，-0.703，均P＜0.05）。

表3 血清Klotho，OTA，Bcl-3 与肾功能指标的相关性

2.4 血清Klotho，OTA 和Bcl 3 水平对CKD Ⅲ～Ⅴ期患者的预后影响 随访6～36 个月，平均随访时间21.58±6.12 个月，47 例患者发生肾脏结局事件，肾脏存活71 例，肾脏存活率为60.17%（71/118）。低Klotho 组肾脏存活率为44.83%（26/58），低于高Klotho 组的75.00%（45/60）,差异具有统计学意义（Log rankχ2=6.988，P=0.008）；高OTA 组肾脏存活率为40.68%（24/59），低于低OTA 组的79.66%（47/59），差异具有统计学意义（Log rankχ2=7.247，P=0.000）；高Bcl-3 组肾脏存活率为46.67%（28/60），低于低Bcl-3 组的74.14%（43/58），差异具有统计学意义（Log rankχ2=7.198，P=0.000），见图1。

图1 Kaplan Meier 曲线分析血清Klotho，OTA，Bcl 3 对肾脏存活率的影响

2.5 单因素及多因素COX 回归分析影响肾脏结局事件的因素 见表4，5。24h 尿蛋白量升高，eGFR 降低、血清Klotho 降低，OTA 升高，Bcl-3升高是影响CKD Ⅲ～Ⅴ期患者肾脏结局事件发生的独立危险因素。

表4 单因素COX 回归分析影响肾脏结局事件发生的因素

表5 多因素COX 回归分析影响肾脏结局事件发生的因素

3 讨论

我国CKD 疾病负担重，患病率约为10.8%，其中CKD Ⅲ～Ⅴ期患病率相对较低，但更容易进展为终末期肾病，需要接受肾脏替代治疗维持机体内环境稳定[12]。目前CKD 尚无有效的防治手段，早诊断、早治疗及预后预测对于提高CKD 患者的肾脏存活率至关重要。CKD 的病因多样，包括高血压、糖尿病及急性肾损伤等已知病因，也可由环境中的有毒物质等因素导致。各种因素引起肾内外细胞的氧化应激、炎症性损伤，导致肾间质中成纤维细胞的活化、肾小球硬化等病理改变，促进CKD 向终末期肾病的发展。深入研究CKD 的病因及疾病机制，识别CKD 尤其是CKD Ⅲ期以上患者肾功能进展的危险因素，有助于临床早期识别高危患者。

Klotho 蛋白是一种单跨膜蛋白，其细胞外结构域可以被金属蛋白酶切割释放到血清、尿液和脑脊液等体液中被检测到。功能上，Klotho 是一种肾脏保护因子，参与维持钙磷平衡调节，并作为一种抗炎因子抑制肾纤维化发挥其保护肾功能的生物学效应[13]。本研究中，CKD 患者血清Klotho 水平降低，这与FREUNDLICH 等[5]学者研究报道一致，该研究证实在CKD 患者早期即出现血清和尿液中Klotho 水平降低，是早期诊断CKD 的生物标志物。CKD 中Klotho 水平降低的机制可能与转录后调控异常有关。MENCKE 等[14]发现，多种有害刺激诱导肾小管上皮细胞损伤后，无义mRNA 降解因子能够促进Klothom RNA 降解，导致Klotho 蛋白的翻译和分泌减少。本研究发现，CKD 分期越高，血清Klotho 水平降低更为明显，提示血清Klotho水平能够反映CKD 疾病严重程度。LIU 等[15]发现，Klotho 作为成纤维细胞生长因子23 受体的共受体，其表达下调抑制成纤维细胞生长因子23 及下游细胞外信号调节激酶1/2 通路，导致磷酸钠协同转运蛋白表达缺失，近端肾小管上皮细胞不能排泄磷酸盐，导致血磷升高，加重肾功能损伤。此外，Klotho 的表达降低能够促进转化生长因子β 结合到转化生长因子β Ⅱ受体，诱导肾小管上皮细胞发生上皮间质转化，促进肾纤维化[16]。本研究发现，Klotho 低表达的CKD 患者肾脏存活率较低，并且Klotho 低表达是CKD Ⅲ～Ⅴ期患者发生肾结局事件的独立危险因素，表明检测血清Klotho 水平有助于判断CKD Ⅲ～Ⅴ期患者的临床预后，可能是新的预后判断的血清标志物。FREUNDLICH 等[5]学者报道，通过外源性的补充Klotho 或内源性过表达Klotho 能够抑制肾脏纤维化的发生，延缓CKD 的疾病进展。因此，以Klotho 为靶点的临床治疗可能有助于延缓CKD Ⅲ～Ⅴ期患者的疾病进展，增加肾脏存活率，减少肾结局事件的发生，是潜在的临床治疗方案，值得深入研究。

OTA 作为一种真菌毒素，进入机体后主要在胃和近端空肠被吸收，未吸收的OTA 可以到达后肠与肠道菌群相互作用，产生有毒代谢产物，对肾功能造成损伤[17]。近年来发现，血清OTA 在肾结石、慢性肾衰竭及透析患者中表达升高，其表达升高通过激活核因子kB 通路，诱导促炎症微环境，加重肾脏炎症病理损伤[8]。本研究中，CKD 患者血清OTA 显著升高，其原因一方面是CKD 患者胃肠道黏膜上皮细胞功能障碍，肠黏膜上皮细胞完整性破坏、黏液屏障的丧失及肠道菌群失调，均导致OTA 吸收增加[18]。另一方面，由于肾脏是OTA 的主要排泄器官，CKD 患者肾小球滤过率的下降导致血清OTA 水平的升高。本研究中，CKD 分期越高，血清OTA 水平升高越明显，提示血清OTA 升高与CKD 疾病严重程度有关。其机制是OTA 能够激活肾纤维化基因如α-SMA及波形蛋白等的表达，促进肾纤维化的发生，加重肾功能损伤[19]。此外，OTA 还能够通过激活NOD 样受体3 炎症小体，促进肾小管上皮细胞发生细胞焦亡，白介素1β 及白介素18 等大量促炎细胞因子释放，加重肾脏炎症反应，促进肾脏功能的恶化[19]。本研究进一步分析发现血清OTA 高表达CKD 患者肾脏存活率较低，提示检测血清OTA 水平有助于CKD Ⅲ～Ⅴ期患者预后预测。DU 等[20]在肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞中进行了体外实验，发现无毒浓度的OTA（0.25 mg/kg）能够激活转化生长因子-β1/SMAD家族成员2 通路，加重阿霉素的细胞毒性及肾纤维化的发生，并在小鼠肾病模型进一步证实，OTA 增加了肾病小鼠中纤维化因子、α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白的表达，诱导的肾纤维化加重，肾损伤加重。因此，血清OTA 是一种新的CKD Ⅲ～Ⅴ期患者预后相关血清标志物，值得临床关注。

Bcl-3 编码基因位于19q13.32，编码蛋白是一种转录共激活因子，通过结合核因子kB，发挥调控下游靶基因表达的作用，广泛参与炎症、肿瘤及CKD 等疾病的病理生理学过程[10,21]。本研究发现，CKD 患者血清Bcl-3 表达升高，其机制尚不清楚，可能是转化生长因子β 信号通路的激活促进Bcl-3 表达。BARINOTTI 等[10]学者在单侧输尿管梗阻的动物模型中发现，在肾梗阻纤维化早期，肾小管上皮细胞损伤凋亡后Bcl-3 释放到血清中，导致血清Bcl-3 水平升高。此外，梗阻肾组织中转化生长因子β 表达升高能够促进Bcl-3 的表达，导致下游肾纤维化基因如α-平滑肌肌动蛋白表达上调，导致肾功能恶化[10]。本研究中，血清Bcl-3 水平与CKD 疾病严重程度有关，且与eGFR 呈显著正相关，与BARINOTTI 等[10]学者报道一致，提示血清Bcl-3 水平升高参与促进CKD 的疾病进展。Bcl-3 能够通过激活转化生长因子β 信号通路的传导，促进肾纤维化。CARR 等[22]研究发现，Bcl-3与SMAD 家族成员3 结合并保护SMAD 家族成员3 免于泛素化和降解，进而激活转化生长因子β 信号通路，促进肾小管细胞发生上皮间质转化及肾间质纤维化，导致CKD 疾病进展。本研究中，血清Bcl-3 高表达CKD 患者肾脏存活率较低，是影响肾结局事件发生的独立危险因素。因此，Bcl-3 是一种新的反映CKD 疾病进展的血清标志物，有助于评估CKD Ⅲ～Ⅴ期患者的临床预后。本研究中，血清Klotho 与OTA，Bcl-3 表达呈显著负相关。研究表明，核因子kB 能够抑制肾小管上皮细胞Klotho 的表达，而Bcl-3 作为核因子kB 的辅因子，在促炎因子的刺激下能够增强核因子kB 的表达及活性，进而抑制Klotho 的表达[23]。此外，OTA 的肾毒性损伤肾小管上皮细胞，并促进白介素1β，白介素-6 等促炎因子的释放，而这些促炎因子能够激活核因子E2 相关因子2，抑制抗衰老因子Klotho 的表达，促进细胞衰老[24]。但三者之间的关系及在CKD 中的作用机制有待今后深入探索。

综上所述，CKD Ⅲ～Ⅴ期患者血清Klotho 水平降低，OTA 和Bcl-3 水平升高，血清Klotho，OTA 和Bcl-3 水平与eGFR 有关，有助于反映CKDⅢ～Ⅴ期患者疾病严重程度。血清 Klotho 降低，OTA 升高，Bcl-3 升高是影响CKD Ⅲ～Ⅴ期患者肾脏结局事件发生的独立危险因素，为预后评估提供参考价值。但本研究样本量有限，未对CKD Ⅲ～Ⅴ期患者进行分层分析，有待今后设计多中心临床试验，扩大样本量进一步验证本研究的结论。