宏基因组测序技术检测血流感染样本去宿主干扰效应四种预处理方法的比较

贾适瑜，王飞燕，杨琳梅，耿 洁，李 峰，高 简，周 洲，程 军（.中国医学科学院阜外医院实验诊断中心，北京 00037；.云南省阜外心血管病医院检验科，昆明 6500）

血流感染(blood stream infection,BSI)是指各种病原微生物侵入血流而引起的一种严重全身感染性疾病[1]。随着侵入性操作、广谱抗生素及免疫抑制剂等的广泛应用，血流感染的发生率呈逐年上升趋势[2]。血流感染的早期诊断对缩短住院时长、减少治疗费用、降低病死率有重要意义。目前，其诊断主要依赖于传统培养方法，但存在报告时间长、苛养菌培养困难等缺点[3-4]。分子生物学检测具有高灵敏度、高特异度及报告时间短等优点，已成为难培养病原微生物检测的重要手段。但多数分子生物学方法只能检测某些特定类型的病原微生物[5-6]，无法满足临床对疑难重症感染的诊断需求。宏基因组测序（metagenomic next generation sequencing,mNGS）技术则可在感染早期不受靶标限制从样本中直接检测包括细菌、病毒、真菌和寄生虫在内的所有病原微生物[7]。然而，血流感染患者初始病原微生物浓度在1～103CFU/ml 之间[8-9]，大量宿主核酸限制了血液中病原微生物的检测，如何降低宿主核酸对病原微生物的影响，成为mNGS 亟需解决的问题。因此，建立高效、标准化的病原微生物核酸分离方法对于血流感染的早期诊断至关重要。本研究通过mNGS 检测预处理后的模拟血流感染样本，旨在评估Saponin 法、Wash 法、CD45 法和MolYsis 法四种预处理方法的去宿主效率[10-13]。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择金黄色葡萄球菌ATCC25923标准菌株模拟血流感染样本，来自无感染患者的全血混合样本作为基质和阴性对照。血液样本纳入标准为：患者无发热，血细胞检测、血清降钙素原、C 反应蛋白和红细胞沉降率结果未见异常。该研究已通过伦理审查委员会批准。研究对象均知情同意。

1.2 仪器与试剂 核酸提取选用ZymoBIOMICSDNA minipre Kit 试剂盒（ZYMO RESEARCH 公司，货号D4300），核酸定量使用Qubit High Sensitivity dsDNA assay 试剂盒（ThermoFisher SCIENTIFIC 公司，货号32851）。去宿主部分使用热不稳定性耐高盐核酸酶HL-SAN（ActicZymes 公司，货号70910-202），Saponin 干粉（Sigma-Aldrich 公司，货号47036），蛋白酶K 冻干粉（北京索莱宝科技有限公司，货号P9460），Dynabeads®CD45 试剂盒（ThermoFisher SCIENTIFIC 公司，货号11153D），MolYsis™ Basic5 试剂盒（Molzym 公司，货号D-301）。mNGS 部分使用Bioruptor 超声打断仪（Diagenode 公司，型号Bioruptor Plus），Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析仪（Agilent 公司，型号G2939B），Agilent High Sensitivity DNA Kit（Agilent公司，货号5067-4626），ABI 7500 荧光定量PCR仪（ThermoFisher SCIENTIFIC 公司，型号ABI 7500），Illumina Nextseq 测序平台（Illumina 公司，型号Nextseq 500）。

1.3 方法

1.3.1 模拟血流感染样本制备：将ATCC25923 标准菌株接种在血琼脂平板上培养24h 后，制备0.5麦氏单位的菌悬液。用临床全血混合样本作为稀释液，将菌悬液进一步稀释至105，103，102，10CFU/ml，最终制备体积为10ml 的不同浓度的模拟血流感染样本，剩余的临床全血混合样本作为阴性对照。

1.3.2 四种去宿主方法处理样本：根据方法学适用条件将检测分为全血组和血浆组，全血组包括Saponin 法、CD45 法和MolYsis 法，血浆组包括Saponin 法、Wash 法，每份样本进行二次重复检测。

1.3.2.1 Saponin 法：取8ml 模拟样本，800r/min离心5min，转移上层血浆至新的EP 管；将血浆9 000r/min 离心5min 后，弃上清液，吸取200μl PBS 重悬沉淀,再加入200μl 5%Saponin 溶液（5g Saponin 溶于95g 双蒸水），37℃振荡孵育15min，孵育过程中每2min 混匀1 次；孵育完成后加入350μl 无菌水，静置30s，再加入12μl 5mol/L 的NaCl 溶液，涡旋混匀。8 000r/min 离心5min，弃上清液，加入100μl PBS 重悬沉淀，再加入100μl的HL-SAN buffer（5.5mol/L NaCl，100mmol/L MgCl2水溶液），涡旋混匀。加入10μl HL-SAN，立即混匀，37℃1 300r/min 孵育15min；加入1ml PBS，8 000r/min 离心3min，弃上清液；1ml PBS重悬，8 000r/min 离心3min，弃上清液，250μl PBS 重悬沉淀，重悬液用于核酸提取。

1.3.2.2 Wash 法：取8ml 模拟样本，3 200r/min 离心30s，取血浆至新的5ml 低吸附管内,并加入等体积无菌水，涡旋混匀；室温孵育5min，期间不断混匀；13 300r/min 离心2min；弃上清，吸取250μl PBS 重悬沉淀，重悬液用于核酸提取。

1.3.2.3 CD45 法：具体参照Dynabeads®CD45 说明书。

1.3.2.4 MolYsis 法：具体参照MolYsis™ Basic5试剂盒说明书。

1.3.3 DNA 提取和mNGS 样本经过预处理去宿主之后，使用Zymo BIOMICS DNA minipre Kit 试剂盒提取DNA，Qubit High Sensitivity dsDNA assay进行核酸定量。用Bioruptor 将提取的DNA 片段化。使用Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析仪及配套的Agilent High Sensitivity DNA Kit 对片段化的DNA 验证后制备文库。PCR 扩增使用ABI 7500 荧光定量PCR 仪。测序使用Illumina Nextseq 平台，每个血流感染样本的测序量为2.5G。测序完成后使用Burrows-Wheeler Alignment（BWA）将人基因组数据与GRCh38 进行序列比对去除宿主基因[14]。剩余的测序数据通过SNAP 与NCBI nt 数据库比对，最终获得靶物种reads 检出数和丰度信息。所有mNGS 阳性结果均经Sanger 测序验证。

1.4 统计学分析 采用Python3.9 软件作为数据统计分析工具，计量资料服从正态分布并以均数±标准差（±s）表示，去宿主方法组间比较采用配对样本t检验；全血组及血浆组病原微生物核酸检出情况组间比较采用卡方检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 全血组不同去宿主方法病原微生物检出情况比较 全血组不同去宿主方法金黄色葡萄球菌reads检出数结果见表1，可见阴性对照的reads 检出数小于5 条；病原微生物检出结果占比见表2。直接提取法微生物检出占比均小于0.15%，去宿主处理可提升血流感染病原微生物的reads 检出数，提高血流感染病原菌的占比。从检测结果来看，Saponin法病原微生物reads 检出数最多，微生物占比最高，其中102CFU/ml 水平差异有统计学意义，其余浓度reads 检出数也明显增加，但因样本量相对较小，样本间差异离散度较大,导致差异无统计学意义。CD45 法病原微生物检出数相比直接提取法均未显著增加，102及103CFU/ml 样本检出的reads 检出数有所降低，差异无统计学意义。MolYsis 法由于样本及试剂问题，只有102和105CFU/ml 水平有检测结果，102CFU/ml 样本水平虽只有1 个检测结果，其reads 检出数相较其他方法明显增加，105CFU/ml样本水平reads 检出数较其他方法亦明显增加，差异有统计学意义，可见该方法具有较好的去宿主效果。

表1 全血组不同去宿主方法金黄色葡萄球菌reads 检出数差异（±s）

注：-表示无数据。t1 和P1 为直接提取法和Saponin 法reads 检出数比较，t2 和P2 为直接提取法和CD45 法reads 检出数比较，t3 和P3 为直接提取法和MolYsis 法reads 检出数比较。

稀释浓度(CFU/ml) 直接提取法Saponin 法CD45 法MolYsis 法t1P1t2P2t3P3 0 3.50±0.71---------1015.50±3.54622.00±808.9343.00±24.04--1.08 0.47 -1.08 0.47--10221.50±6.3611 048.50±241.1216.50±3.5419 696.00-63.01 0.01 -63.01 0.01 1.29 0.42 1031 960.00±325.27 16 145.00±1292.59411.50±70--12.40 0.05 -12.40 0.05--1052 771.50±67.18 1 437 398.50±532 668.49 10 156.00±1117.23 4 681 562.00±138 810.72 -3.81 0.16 -3.81 0.16 -47.64 0.01

表2 全血组不同去宿主方法金黄色葡萄球菌占比情况（%）

2.2 血浆组不同去宿主方法病原微生物检出情况比较 血浆组不同去宿主方法金黄色葡萄球菌reads检出数见表3。序列比对后，不同去宿主方法金黄色葡萄球菌检出结果占比见表4。与直接提取法相比，Saponin 法reads 检出数最多，各水平reads 检出数均明显高于其他方法，但由于批内检测差异较大，仅105CFU/ml 水平差异有统计学意义。Wash 法reads 检出数低于Saponin 法，病原微生物检出数和非宿主比例均未显著增加，且102CFU/ml 水平reads检出数有所丢失，检出效果明显不如Saponin 法。

表3 血浆组不同去宿主方法金黄色葡萄球菌reads 检出数差异（±s）

表3 血浆组不同去宿主方法金黄色葡萄球菌reads 检出数差异（±s）

注：-表示无数据。t1 和P1 为直接提取法和Saponin 法reads 检出数比较，t2 和P2 为直接提取法和Wash 法reads 检出数比较。

稀释浓度(CFU/ml)直接提取法Saponin 法Wash 法t1P1t2P2 0 6.00±2.83------10137.50±28.99792.00±377.60814.50±729.03-3.060.20-1.570.36 102161.50±40.319 125.00±7 997.38121.00±4.24-1.580.361.290.42 1032159.50±454.6751 856.00±20 719.643 499.50±587.61-3.470.18-14.260.04 10562 295.00±5 731.812 966 242.00±42 284.9992 549.50±6 183.65-85.530.01-94.690.01

表4 血浆组不同去宿主方法金黄色葡萄球菌占比情况（%）

2.3 全血组及血浆组金黄色葡萄球菌核酸检出情况比较 将Saponin 法和直接提取法的血浆和全血检测结果进行比较（见表5），可见Saponin 法模拟样本四个水平血浆组检测结果均高于全血组，差异有统计学意义（P＜0.01)，且Saponin 法血浆组金黄色葡萄球菌检测结果占比均提高至18%以上。直接法血浆组检测结果和全血组结果差异均无统计学意义（P＞0.05)。

表5 全血组及血浆组金黄色葡萄球菌核酸检出占比情况比较

3 讨论

mNGS 作为不经培养直接从临床标本中鉴定出病原微生物的分子诊断技术，具有高灵敏度、高通量及无偏倚检测的优势，可显著提高疑难重症感染的诊断效率[15-16]。然而由于mNGS 采用鸟枪法测序，大多数病原微生物的检测会受宿主高核酸背景（通常＞99%）的影响，从而使病原微生物的检出数据不足，大大限制了该方法的分析灵敏度。虽然增加测序深度可提高病原微生物的检出，但当测序深度达平台期（约20M）后，增加测序深度不能显著提升其检测性能，检测时间和成本却大幅增加。为了避免低载量病原微生物的漏检，减少实验部分的干扰，去宿主步骤成为mNGS 的重要环节。目前国内外去宿主研究主要针对呼吸道、脑脊液等体液及其他包含微生物菌群的组织标本类型，血流感染去宿主相关研究仍相对较少[17-19]。

血液样本去宿主和富集微生物核酸的方法主要包括：①差速离心或过滤等基于细胞大小差异的方法去除宿主细胞；②差异裂解法选择性裂解宿主细胞，然后用酶或化学试剂去除暴露的核酸[20]。Saponin 作为表面活性剂对人源细胞膜进行裂解，细菌和真菌由于有细胞壁的保护可免受裂解，同时渗透压可以差异裂解细胞膜，随后利用高盐溶液破坏宿主细胞释放出的染色体，非特异性核酸内切酶HL-SAN 对宿主核酸进行切割，洗涤后即完成了去宿主过程[10]。Wash 法则是基于宿主细胞与微生物大小差异，使用不同离心条件对宿主细胞进行清除，该方法简单易操作，不需要特殊仪器设备，可去除完整性较好的人源细胞，缺点在于操作引入误差较大，去宿主的均一性无法保证，多次离心及洗涤步骤减少人源核酸的同时易造成病原微生物的丢失。CD45法则是利用共价偶联抗人CD45 抗体的超顺磁性微珠，直接从全血去除CD45+白细胞，操作简便省时，但无法去除不表达CD45 的白细胞。MolYsis 法使用离液剂和去污剂选择性裂解哺乳动物细胞，之后用不受离液剂和去污剂影响的DNA 酶消化，随即对病原微生物进行裂解，高效分离并富集目标核酸，且不引入任何外源微生物（如工程菌），可同时富集病原菌，但是价格昂贵，本研究由于样本及试剂问题，只有部分检测结果，结果证明该方法确实具有较好的去宿主效果，后续可用临床样本进一步证实。朱盈等[21]通过对比Saponin 法、SDS 法和水洗法对血流感染样本的去宿主效率，发现Saponin 法的去宿主效率最优，与本研究结果一致。

本研究尚存在一定的局限性。首先由于不同浓度梯度的样本量较小，宿主背景下病原检测结果不够稳定，后续需要增加样本量并使用真实样本进一步验证。其次本研究只将金黄色葡萄球菌纳入研究，涉及的菌谱不够全面，后续会将革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、病毒等纳入研究范围，且充分考虑不同耐药基因对mNGS 检测的影响。未来将对mNGS 的灵敏度、重复性和特异度等方法学性能进行系统验证，评估血流感染mNGS 检测的全流程。

综上，本研究通过比较Saponin 法、Wash 法、CD45 法和MolYsis 法四种预处理方法的去宿主干扰效应，明确了Saponin 法血浆组的去宿主效率最高。为后续mNGS 的相关研究奠定了基础，对血流感染的早期精准诊断具有重要意义。