血浆外泌体miR-4306表达水平联合CT征象对单发非实性肺结节良恶性鉴别的价值研究

赵 波，刘永利，李京京

（1.秦皇岛市第一医院，河北秦皇岛 066000；2 秦皇岛市海港医院CT 室，河北秦皇岛 066000）

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其致死率高达21%[1-2]。中国肺癌的发病率和死亡率均位居所有恶性肿瘤榜首[3]。早期筛查肺癌可有效改善患者预后。CT 是肺结节良恶性鉴别的主要工具，但常出现“同病异影”、“异病同影”及不同医师对同一结节的良恶性鉴别存在分歧等情况[4]。肺穿刺活检是诊断肺癌的金标准，因存在一定侵入性和漏检率，临床应用存在一定制约。GSE71661 分析结果显示恶性肺结节患者血浆外泌体中微小核糖核酸（miR）-4036 水平升高，或许可用于肺结节良恶性鉴别。目前，鲜有研究分析血浆外泌体miR 4306在肺结节良恶性鉴别中的价值。该研究主要分析外泌体miR-4306 联合CT 征象对单发非实性肺结节良恶性鉴别的价值，以期为恶性肺结节的早筛提供帮助。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2020 年8 月～2022 年6 月就诊于秦皇岛市第一医院行CT 检查发现单发肺结节的153 例患者作为研究对象，年龄40～69（54.56±6.92）岁；男性111 例，女性42 例。纳入标准：①单发肺磨玻璃结节，且大小≤30 mm；②病例资料完整。排除标准：①既往有肺癌史；②CT 检查前已接受肺癌相关治疗；③其他原发肿瘤；④肺部急性感染或活动性肺结核；⑤主动脉夹层或冠心病。该研究患者签署知情同意书，获秦皇岛市第一医院医学伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 PCR 仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]，外泌体提取试剂盒（美国SBI 公司），TRIzol 试剂和逆转录试剂盒（日本TAKARA 公司），miR-4306和U6引物（上海吉玛制药技术有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 GSE71661 数据下载及分析：从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）下载GSE71661 数据。用R 语言4.1.1 版软件中“limma”包分析良性和恶性肺结节患者血浆外泌体中差异表达的miRNAs。

1.3.2 miR-4306 水平检测：于患者CT 检查当天用含肝素钠的采血管抽取其空腹时肘部静脉血10 ml，离心后取上清液，加入凝血活素，孵育后离心，取上清液；将EXOQ5TM-1 外泌体提取试剂加至上清液中，孵育后离心，去上清后再次离心，重悬沉淀，用透射电镜、粒径分析及蛋白标志物鉴定外泌体。用TRIzol 试剂提取外泌体中RNA，用逆转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA，用PCR 仪扩增cDNA，扩增条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40 个循环。miR-4306 上游引物：5’-TGGAGAGAAAGGCAGT A-3’，下游引物5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6 上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATA CT-3’，下游引物5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。用2-ΔΔCt法计算miR-4306 相对内参U6 的水平。

1.3.3 CT 检查：用荷兰飞利浦公司的128 排256层螺旋CT 扫描，扫描参数为管电流100～200 mA，管电压120 kV，矩阵1 024×1 024，螺距1.2，重建层厚1.0 mm，层间距1.0mm，扫描范围为肺尖至膈底。记录病灶类型（纯磨玻璃结节、混合磨玻璃结节）、结节最长径、瘤肺界面是否清晰、有无分叶征、毛刺征、血管集束征、空泡征、胸膜凹陷征及充气支气管征等征象。由2 名副主任医师阅片，若出现分歧，协商至一致。

1.3.4 病理检查：所有患者均接受病理检查。取手术或经皮肺穿刺获取的肺活组织进行病理学检查，确诊结节是否为恶性。由2 名副主任医师阅片，若出现分歧，协商至一致。

1.4 统计学分析 用SPSS 23.0 版和R 语言4.1.1版软件行统计学分析。计量资料用均值±标准差（±s）或中位数（四分位数间距）[M（Q1，Q3）]表示，两组间差异比较用独立样本t或Mann-Whitney 检验。计数资料用n（%）表示，组间差异比较用χ2检验。用Lasso-Logistic 回归分析恶性肺结节的风险因素，用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线和决策树曲线评价外泌体miR 4306 联合CT 征象诊断恶性肺结节价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GSE71661 分析结果 见图1。与良性肺结节比较，恶性肺结节患者血浆外泌体中存在173 个差异表达的miRNAs，其中上调73 个，下调100 个。恶性肺结节患者血浆外泌体中miR 4306 表达水平高于良性肺结节患者（logFC=2.185，P=0.026）。

图1 良恶性肺结节患者血浆外泌体中差异表达的miRNAs

2.2 良性组和恶性组miR-4306 水平比较 153 例肺结节中良性21 例（良性组），其中炎性病变7例、炎性假瘤5 例、纤维组织增生8 例、错构瘤1例；恶性132 例（恶性组），其中不典型腺瘤样增生4 例、原位腺癌4 例、微侵袭性腺癌9 例、侵袭性腺癌115 例。外泌体透射电镜、粒径分析及蛋白标志物鉴定的图像见图2。恶性组的血浆外泌体miR 4306 水平为1.28（1.11，1.71），高于良性组[1.03（0.96，1.07）]，差异具有统计学意义（Z=4.266，P=0.000）。

图2 外泌体鉴定图像

2.3 良性组和恶性组CT 征象比较 见表1。二组的年龄、性别、结节最长径、分叶征占比、毛刺征占比和空泡征占比差异均无统计学意义（均P＞0.05）。恶性组的混合磨玻璃结节占比、瘤肺界面清晰占比、血管集束征占比、胸膜凹陷征占比和充气支气管征占比均高于良性组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 良恶性肺结节患者CT 征象比较[±s，n(%)]

表1 良恶性肺结节患者CT 征象比较[±s，n(%)]

项 目良性组（n=21）恶性组（n=132）t/χ2P年龄（岁）54.52±7.1554.56±6.910.0230.982性别 男16（76.19）95（71.97）0.1620.687女5（23.81）37（28.03）病灶类型 纯磨玻璃结节16（76.19）49（37.12）11.3180.001混合磨玻璃结节5（23.81）83（62.88）结节最长径（mm）17.33±4.3116.37±3.711.0790.282瘤肺界面 清晰12（57.14）124（93.94）24.8380.000不清晰9（42.86）8（6.06）分叶征 有10（47.62）71（53.79）0.2770.599无11（52.38）61（46.21）毛刺征 有11（52.38）63（47.73）0.1570.692无10（47.62）69（52.27）血管集束征 有5（23.81）64（48.48）4.4550.035无16（76.19）68（51.52）空泡征 有8（38.10）50（37.88）0.0040.985无13（61.90）82（62.12）胸膜凹陷征 有3（14.29）61（46.21）7.5900.006无18（85.71）71（53.79）充气支气管征 有4（19.05）60（45.45）5.1920.023无17（80.95）72（54.55）

2.4 恶性肺结节的风险因素分析 见图3 和表2。最佳λ=0.55，Lasso 筛选的风险因素包括病灶类型（系数值0.435）、瘤肺界面（系数值1.407）、胸膜凹陷征（系数值0.321）和外泌体miR-4306（系数值0.751）。将肺结节良恶性作为因变量（良性=0，恶性=1），将病灶类型（纯磨玻璃结节=0，混合磨玻璃结节=1）、瘤肺界面（不清晰=0，清晰=1）、胸膜凹陷征（无=0，有=1）和外泌体miR-4306[按四分位数分段赋值：≤1.03=0，1.03～1.14（含等于）=1，1.14～1.66（含等于）=2，＞1.66=3]作为自变量，Logistic 回归分析结果显示，混合磨玻璃结节、瘤肺界面清晰、胸膜凹陷征和外泌体miR-4306＞1.03 均是恶性肺结节重要预测指标。

表2 恶性肺结节风险因素Logistic 回归分析

图3 Lasso 回归分析结果

2.5 外泌体miR-4306 联合CT 征象鉴别良恶性肺结节的价值 见图4 和表3。CT 征象诊断恶性肺结节的方程F=-1.277+1.700×病灶类型+2.381×瘤肺界面+1.840×胸膜凹陷征，外泌体miR-4306+CT 征象诊断恶性肺结节的方程F=-6.052+3.568×外泌体miR- 4306+1.650×病灶类型+2.607×瘤肺界面+2.227×胸膜凹陷征。ROC 曲线显示，外泌体miR-4306+CT 征象诊断恶性肺结节的ROC 曲线下面积高于CT 征象和外泌体miR-4306。决策树曲线显示，在阈值概率的大部分范围内，外泌体miR-4306+CT 征象诊断恶性肺结节的净收益高于CT 征象和外泌体miR-4306。

表3 外泌体miR-4306 联合CT 征象鉴别良恶性肺结节的ROC 曲线结果

图4 外泌体miR-4306 联合CT 征象鉴别良恶性肺结节的价值比较

3 讨论

近年来，肺癌的早期诊断取得了一定进展，但患者的预后仍无明显改善，随分期增加，生存率明显下降[5]。因此，肺癌的早筛仍有待加强。该研究主要分析外泌体miR-4306 联合CT 征象对单发非实性肺结节良恶性鉴别的价值。

既往关于miR-4306 的报道主要集中在乳腺癌[6-7]和食管癌[8-9]等方面，关于其与肺癌的研究鲜有报道。外泌体是一种具有双层脂质的囊泡，负责细胞间信息传递，介导了肺癌的发生发展过程。该研究结果显示，恶性组的外泌体miR-4306 水平高于良性组，提示外泌体miR-4306 水平高与恶性肺结节相关，或许可用于肺结节良恶性鉴别。该研究良性肺结节样本量有限，为保证Logistic 回归分析结果可靠性，用Lasso 回归对自变量进行了筛选，结果显示，外泌体miR-4306 与恶性肺结节密切相关。该研究Logistic 回归分析结果显示，外泌体miR-4306＞1.03 是恶性肺结节重要预测指标。目前，关于miR-4306 在恶性肺结节发生发展中的作用仍未阐明。现有报道指出，miR-4306 可靶向同源异形盒基因1/细胞分裂周期蛋白42/血管内皮生长因子A 通路抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移，并在体外抑制血管和淋巴管生成[6]。此外，miR-4306 还靶向同源异形盒基因3 抑制食管鳞状细胞癌细胞增殖[8]。推测miR-4306 可能通过调控上述靶点或通路参与肺癌发生发展过程，关于其机制有待开展基础研究证实。

该研究恶性组的混合磨玻璃结节占比、瘤肺界面清晰占比、血管集束征占比、胸膜凹陷征占比和充气支气管征占比均高于良性组，表明混合磨玻璃结节、瘤肺界面清晰或具备血管集束征、胸膜凹陷征和充气支气管征的肺结节恶性几率较高，提示上述特征对于肺结节良恶性的鉴别有一定帮助。Lasso 回归结果显示，病灶类型、瘤肺界面、胸膜凹陷征和外泌体miR-4306与恶性肺结节密切相关。MAZZONE等[10]研究指出，在不同密度的肺结节中，部分实性的肺结节恶性几率最高，其次是实性结节。良性肺结节因炎性细胞浸润，瘤肺界面通常不清晰[11]。此外，还有研究[12]指出瘤肺界面清晰是恶性肺结节的重要预测指标。胸膜凹陷征象常被用于肺磨玻璃结节良恶性的鉴别，该征象形成与肿瘤病灶内纤维化密切相关，肿瘤病灶内细胞增殖旺盛、易缺氧，导致病灶纤维化收缩，最终形成该征象。目前，已有多数研究[13-14]证实胸膜凹陷征与恶性肺结节相关。该研究Logistic 回归分析结果显示混合磨玻璃结节、瘤肺界面清晰和胸膜凹陷征均是恶性肺结节重要预测指标，与上述研究结果相符。

CT 征象病灶类型、瘤肺界面和胸膜凹陷征在肺结节良恶性鉴别诊断中仍存在一定不足，该研究构建了外泌体miR-4306 联合病灶类型、瘤肺界面和胸膜凹陷征判断肺结节良恶性的ROC 曲线，结果显示外泌体miR-4306+CT 征象诊断恶性肺结节的ROC 曲线下面积高于CT 征象和外泌体miR-4306，该结果提示，与CT 征象或外泌体miR-4306相比，外泌体miR-4306+CT 征象对恶性肺结节有更高的区分度。决策树曲线显示，在阈值概率的大部分范围内，外泌体miR-4306+CT 征象诊断恶性肺结节的净收益均高于CT 征象和外泌体miR-4306，该结果提示，与CT 征象或外泌体miR-4306相比，外泌体miR-4306+CT 征象对恶性肺结节的鉴别有更高的临床应用价值。

该研究存在一定选择偏倚，一是选取的受试者均为接受手术或经皮肺穿刺的患者，肺结节恶性可能性更高；二是仅选取了纯磨玻璃结节和混合磨玻璃结节的患者进行研究，未纳入实性结节患者，后续将增加实性结节患者进行研究。

综上所述，外泌体miR-4306＞1.03，混合磨玻璃结节、瘤肺界面清晰和胸膜凹陷征均是恶性肺结节重要预测指标。上述指标联合对肺结节良恶性鉴别有一定价值。