甲状腺癌患者组织及手术前后血清中NR3C2和ZEB1表达水平及其与预后价值研究

仲亚东，孔德桐，马伯敏（.邹城市人民医院乳甲血管疝外科，山东济宁 7500；.泗水县人民医院普外科，山东济宁 700；.鱼台县人民医院肿瘤科，山东济宁 700）

甲状腺癌（thyroid cancer）是病变于甲状腺滤泡上皮，颈部出现肿块或结节等临床特征的恶性肿瘤疾病[1]。据统计，甲状腺癌发病增长率正在逐年上升，且发病年龄呈年轻化趋势，女性群体居多。甲状腺癌发病机制复杂，通常被认为受遗传因素、碘缺乏、雌激素水平和电离辐射等因素影响，及时诊断治疗可有效延长患者预后生存期[2-3]。近年来研究发现，核受体亚家族3C 组成员2（nuclear receptor subfamily 3,group C,member 2，NR3C2）在多种恶性肿瘤发展中发挥抑癌作用，例如：NR3C2的高表达可以抑制胰腺癌细胞生长增殖，抑制肾癌细胞的生长，延长患者的生存期。但NR3C2 在甲状腺癌患者中的表达和作用机制尚未被研究[4-6]。E 盒结合锌指蛋白1（E-box-binding zinc finger protein 1，ZEB1）是一种转录因子，据报道，ZEB1 在多种肿瘤疾病中异常表达，参与肿瘤细胞的迁徙、转移，如肺腺癌、结直肠癌、甲状腺癌等[7-9]。既往研究发现，ZEB1 在甲状腺癌中表达异常升高，抑制ZEB1 表达可有效抑制甲状腺癌细胞的侵袭能力，但NR3C2 和ZEB1 在甲状腺癌中的作用机制尚未被深入研究。本研究旨在分析甲状腺癌组织和患者血清NR3C2，ZEB1 表达水平，及其与患者预后的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018 年3 月～2019 年5 月在邹城市人民医院进行手术治疗的85 例甲状腺癌患者的癌组织和癌旁组织（距癌组织＞3cm）样本，分别收集甲状腺癌患者（实验组）手术前、术后1 周、术后1 个月的血清样本，以及同期到本院体检的30例健康者（对照组）血清样本。实验组男性47 例，女性38 例，年龄55～78（62.82±6.59）岁；对照组男性16 例，女性14 例，年龄58～80（63.15±6.88）岁，两组年龄和性别差异均无统计学意义(t=0.233,χ2=0.034,P＞0.05）。收集整理甲状腺癌患者年龄、性别、肿瘤直径、TNM 分期、淋巴结转移、分化程度等临床资料。纳入标准：①患者经病理学确诊为甲状腺癌；②初诊、未接受过颈部相关手术治疗；③研究对象和家属均签署知情同意书。排除标准：①患有肝、肾等其他器官严重疾病；②患有其他恶性肿瘤、血液相关疾病等；③患有高血压、糖尿病者；④基础临床病例资料不全者。本研究内容已经过本院伦理委员会审核通过。

1.2 仪器与试剂 Trizol 试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司），实时荧光定量PCR 试剂盒（武汉默沙克生物科技有限公司），NR3C2 和ZEB1 免疫组织化学法单克隆抗体和二抗试剂盒（上海雅吉生物科技有限公司），7500 荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司），XS-200 光学显微镜（南京江南光电集团股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集：甲状腺癌患者手术后，完整保存患者癌组织和癌旁组织样本备用。分别抽取对照组体检时，实验组手术前、术后1 周、术后1 个月时的静脉血3～5 ml，3 500 r/min 离心10 min，取上清置于-80℃条件下保存备用。

1.3.2 实时荧光定量PCR：采用实时荧光定量PCR方法检测血清NR3C2 mRNA 和ZEB1 mRNA 相对表达量。按照Trizol RNA 提取试剂盒操作说明提取标本中的总RNA，然后将RNA 反转录为cDNA，根据实时荧光定量PCR 试剂盒操作说明进行操作。PCR 反应体系：2×SYBR Green Mix 7.5 µl，上、下游引物各0.5 µl，cDNA 2 µl，加入ddH2O 至20 µl。PCR 反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸10 s，共40 个循环。引物序列见表1，以GAPDH 作为内参基因，采用2-△△Ct值表示相对表达水平。

表1 引物序列

1.3.3 免疫组织化学染色法：取甲状腺癌患者的癌组织标本和对照癌旁组织标本，进行脱蜡水化，用PBS 缓冲液进行彻底冲洗，然后采用微波煮沸的方法将抗原修复，自然冷却至室温后取出玻片，分别用蒸馏水和PBS 缓冲液各进行3 次冲洗，分别加入NR3C2 和ZEB1 的一抗，放入4 ℃冰箱孵育过夜，取出后用PBS 缓冲液充分洗涤4 次，接着加入生物素标记的二抗，室温条件下放置45 min，结束后用PBS 缓冲液充分冲洗3 次，最后进行染色，复染，定色，脱水，封片。用阳性病理切片做阳性对照，PBS 缓冲液代替一抗做阴性对照，然后在显微镜下选取5 个视野观察染色情况。

1.3.4 免疫组织化学结果判定：观察各个染色切片的染色结果，并对其进行评分。评分标准分为两部分：①根据阳性细胞着色强度进行评分，0 分为无着色，1 分为淡黄色，2 分为棕黄色，3 分为棕褐色；②根据阳性细胞着色面积占比进行评分，0 分为占比＜10%，1 分为占比11%～25%，2 分为占比26%～50%，3 分为占比51%～75%，4 分为占比＞75%。将着色强度和着色面积评分相加，总分＜3分为阴性表达，≥3 分为阳性表达。

1.3.5 随访观察：主要以电话及门诊复查的方式对所有甲状腺癌患者随访三年，患者出现复发或癌因死亡时则随访结束，患者随访率为100%。生存时间为术后日期至患者死亡时间或最终随访截止时间。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0 软件包进行数据处理，计数资料以例（%）表示，采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间计量资料采用单因素方差分析，两两比较采用snk-q检验，血清NR3C2 mRNA 和ZEB1 mRNA 表达与患者预后的关系采用Kaplan-Meier 法分析，对数秩检验进行组间生存曲线差异分析，采用多因素COX 回归分析甲状腺癌患者预后影响因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清NR3C2，ZEB1 mRNA 的相对表达水平分析 实验组术前血清NR3C2 mRNA（0.55±0.14）相对表达水平低于对照组（0.97±0.22），术前、术后1 周、术后1 个月血清NR3C2 mRNA（0.55±0.14，0.69±0.15，0.89±0.19）相对表达水平依次升高（t=12.038，q=7.995,19.415,11.421,均P＜0.001）；实验组术前ZEB1 mRNA（1.88±0.28）相对表达水平高于对照组（1.02±0.41），术前、术后1 周、术后1 个月血清ZEB1 mRNA（1.88±0.28，1.43±0.32，1.15±0.29）相对表达水平依次降低（t=12.716，q=13.962,22.649,8.687,均P＜ 0.001），差异均有统计学意义。

2.2 甲状腺癌组织和癌旁组织NR3C2，ZEB1 表达比较 见表2。甲状腺癌组织中NR3C2 阳性表达率（36.47%）显著低于癌旁组织（72.94%），ZEB1阳性表达率（67.06%）显著高于癌旁组织（30.59%），差异具有统计学意义（均P＜0.001）。

表2 甲状腺癌组织及癌旁组织中NR3C2 mRNA，ZEB1 mRNA 的表达情况[n(%)]

2.3 甲状腺癌患者血清NR3C2 mRNA，ZEB1 mRNA相对表达水平与临床病理特征的关系分析 见表3。甲状腺癌患者血清NR3C2 mRNA，ZEB1 mRNA 相对表达水平与TNM 分期、淋巴结转移、分化程度、包膜浸润有关（均P＜0.05）。

表3 血清NR3C2 mRNA，ZEB1 mRNA 的相对表达水平与临床病理特征的关系（±s）

表3 血清NR3C2 mRNA，ZEB1 mRNA 的相对表达水平与临床病理特征的关系（±s）

类 别nNR3C2 mRNAtPZEB1 mRNAtP年龄（岁）＜60410.54±0.140.6830.4971.86±0.280.4670.642≥60440.56±0.131.89±0.31肿瘤直径（cm）＜2480.53±0.111.3130.1931.86±0.250.7060.482≥2370.57±0.171.90±0.27病理类型 乳头状癌460.52±0.141.7280.0881.89±0.270.5460.587其他类型390.58±0.181.86±0.23 TNM 分期 Ⅰ～Ⅱ380.59±0.182.4490.0161.84±0.112.0130.047Ⅲ～Ⅳ470.51±0.121.91±0.19分化程度 低分化400.49±0.163.938＜0.0011.93±0.272.0290.046中、高分化450.61±0.121.83±0.18淋巴结转移 无430.58±0.152.0810.0401.83±0.172.3480.021有420.51±0.161.93±0.22包膜浸润 无390.58±0.142.2120.0301.81±0.242.2960.024有460.52±0.111.95±0.31

2.4 甲状腺癌患者血清NR3C2 mRNA，ZEB1 mRNA相对表达水平与患者三年生存率的关系分析 见图1，图2。以术前患者血清NR3C2 mRNA 和ZEB1 mRNA 相对表达水平进行划分，NR3C2 mRNA 相对表达水平＜0.55 为低表达组，≥0.55 为高表达组，ZEB1 mRNA 相对表达水平＜1.88 为低表达组，≥1.88 为高表达组。NR3C2 mRNA 高表达组患者三年生存率为86.00%（43/50），NR3C2 mRNA低表达组患者三年生存率为40.00%（14/35），两组差异具有统计学意义（χ2=4.168，P＜0.05）；ZEB1 mRNA 高表达组患者三年生存率为35.29%（12/34），ZEB1 mRNA 低表达组患者三年生存率为88.24%（45/51），两组差异具有统计学意义（χ2=5.593，P＜0.05）。

图1 不同NR3C2 mRNA 相对表达水平与甲状腺癌患者三年生存率的关系

图2 不同ZEB1 mRNA 相对表达水平与甲状腺癌患者三年生存率的关系

2.5 甲状腺癌患者预后影响因素的COX 回归分析见表4。以TNM 分期（Ⅰ～Ⅱ期=1，Ⅲ～Ⅳ期=0）、分化程度（低分化=1，中，高分化=0）、淋巴结转移（无=0，有=1）、包膜浸润（无=0，有=1）、NR3C2 mRNA（＜0.55=1，≥0.55=0）和ZEB1 mRNA（≥1.88=1，＜1.88=0）为自变量，生存时间为时间变量，预后（死亡=1，生存=0）为因变量。多因素COX 回归分析显示，TNM 分期、淋巴结转移、包膜浸润、NR3C2 mRNA 和ZEB1 mRNA 相对表达水平为甲状腺癌患者预后影响因素（P＜0.05）。

3 讨论

近年来，甲状腺癌的发病率持续上升，位于我国恶性肿瘤发病增长率首位，且属于年轻群体中最常见的恶性肿瘤之一[10]。甲状腺癌的发生发展是多因素、多阶段、多种基因相互影响作用的复杂过程，其具体的发病机制尚未明确。肿瘤相关信号通路调节异常、表观遗传学修饰、环境致癌物等因素都会影响甲状腺癌的发生与发展过程[11]。甲状腺良性结节与甲状腺癌的临床表现、治疗疗效和患者生存期呈现出不同的表现，及时准确作出判断对患者治疗效果和提高预后生存期具有重要的临床意义[12]。因此，寻找便捷准确的生物学指标进行甲状腺癌早期的诊断治疗对患者预后恢复具有重要意义。

NR3C2 编码盐皮质激素受体（mineralocorticoid receptor，MR），属于核转录因子[13]。NR3C2 存在于机体内包括胃肠道、脑部、心脏、皮肤等多个部位，调节机体内生理活动以维持机体平衡稳定。大量研究表明，NR3C2 参与并影响多种恶性肿瘤病情的发展[14-15]。卢达新等[16]探讨了NR3C2 表达对乳腺癌细胞增殖的影响，结果表明，NR3C2 在乳腺癌组织中呈低表达，并且低表达的NR32C 患者预后生存率低。陈恩更等[17]基于癌症基因组图谱（TCGA）数据库分析影响结肠腺癌（colonic adenocarcinoma，COAD）患者预后的基因，结果发现NR3C2 在COAD 患者组表达下调，NR3C2的表达与患者预后情况相关，但NR3C2 在甲状腺癌中的作用机制尚未被深入研究。本研究结果表明，甲状腺癌组织NR3C2 阳性表达率低于癌旁组织，实验组患者术前、术后1 周、术后1 个月血清NR3C2 mRNA 相对表达水平依次升高，且NR3C2 mRNA 高表达者三年生存率显著高于低表达者，与其在乳腺癌和结肠腺癌中表达情况一致，提示NR3C2 mRNA高表达可能抑制甲状腺癌细胞增殖、分化等活动，与甲状腺癌病程发展密切相关且影响患者预后情况。

ZEB1 广泛存在于机体各个部位，属于ZEB 家族一员，是一类相对保守的转录因子[18]。研究发现，多种miRNA 靶向结合ZEB1 mRNA 的3’非翻译区，从而影响病情的进展[19-20]。黄丽群等[21]研究发现，不同剂量白藜芦醇（resveratrol，Res）对ZEB1 表达水平产生不同程度的下调，从而对细胞侵袭和迁移产生不同程度的影响，Res 可有效的下调ZEB1的表达水平，从而抑制甲状腺癌细胞的侵袭和迁移。本研究结果表明，甲状腺癌组织ZEB1 阳性表达率高于癌旁组织，实验组术前、术后1 周、术后1 个月血清ZEB1 mRNA 相对表达水平依次降低，且ZEB1 mRNA 高表达者三年生存率显著低于低表达者，提示ZEB1 mRNA 高表达可能促进甲状腺癌细胞增殖、分化等活动，与甲状腺癌病程发展密切相关且影响患者预后情况。

本文主要研究了NR32C 和ZEB1 在甲状腺癌组织和血清中的表达情况，以及与患者预后的关系，但其在甲状腺癌发生发展过程中的具体作用机制尚未被深入研究，还需后续进行进一步的实验设计研究。

综上所述，甲状腺癌患者组织和血清NR32C低表达，ZEB1 高表达，其表达均与TNM 分期、淋巴结转移、分化程度、包膜浸润和患者预后有关，且NR32C，ZEB1 表达水平对甲状腺癌患者预后评估具有重要意义。