缺血性脑卒中患者血清LncRNA MEG8表达水平及临床价值研究

王桂瑜，欧阳葵，苏小田，胡琼文（海南省老年病医院老年科，海口 571100）

缺血性脑卒中（ischemic stroke）是由闭塞的动脉造成脑供血不足，从而导致脑组织坏死的一种慢性疾病，发病率逐年增加，对人们的生命安全产生巨大的威胁[1-2]。因此，寻找与缺血性脑卒中相关的生物标志物有助于临床开发新的治疗靶点。长链非编码RNA（long-chain non-coding RNA，LncRNA）能够参与血管生成、炎症等细胞过程的不同信号通路，影响脑损伤的进展[3-4]。LncRNA母系表达基因8（maternal expression gene 8，MEG8）在细胞核表达，能够影响血管生成，在肿瘤、动脉粥样硬化和骨关节炎等疾病中具有重要作用[5-6]。本研究对缺血性脑卒中患者血清中LncRNA MEG8 的水平进行检测，探究其与患者病情危重程度的关系，分析对缺血性脑卒中的诊断价值，以期为缺血性脑卒中的早期诊断提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2021 年1 月～2022 年4 月在海南省老年病医院接受治疗的80 例缺血性脑卒中患者作为观察组，其中男性42 例，女性38 例，平均年龄62.25±11.15 岁，体质量指数21.54±1.08kg/m2，教育年限9.50±1.25 年；高血压25 例，高脂血症20例，糖尿病18 例，心房颤动3 例，吸烟18 例。选取同期85 例健康体检志愿者作为对照组，其中男性45 例，女性40 例，平均年龄60.60±12.20 岁，体质量指数21.38±1.01kg/m2，教育年限9.80±1.40 年；高血压15 例，高脂血症11 例，糖尿病9 例，心房颤动0 例，吸烟5 例。年龄、性别、心房颤动、体质量指数、吸烟、教育年限方面与观察组之间差异均无统计学意义（t/χ2=0.905，0.003，1.486，0.983，0.607，1.449；P=0.367，0.995，0.223，0.327，0.436，0.149），在高血压、高脂血症、糖尿病上与观察组之间差异有统计学意义（t/χ2=4.152，3.928，4.273；P=0.042，0.047，0.039）。参照美国国立卫生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）评分对所有患者病情严重程度进行评估，将观察组分为轻度患者组（n=25，NIHSS＜5分）、中度患者组（n=29，5 ≤NIHSS ≤20 分）和重度患者组（n=26，NIHSS＞20 分）。纳入标准：①患者确诊，符合缺血性脑卒中相关诊断指南[7]；②无其他脑部病变；③无溶血类药物服用者；④年龄＞18 周岁，且自愿签署同意书。排除标准：①既往有脑出血者；②有精神系统方面疾病的患者；③器官有严重衰竭；④无完整临床资料。本研究以人为本、尊重患者、恪守医德、严谨求实，经海南省老年病医院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 组织细胞RNA 提取试剂盒，莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase，M-MLV）反转录试剂盒（北京普非生物科技有限公司，货号：PC2170，PR2555）；荧光定量聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）试剂盒（杭州博日科技股份有限公司，货号：BSB34）；人C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）酶联免疫吸附（enzymelinked-immunosorbent serologic assay，ELISA）试剂盒（上海韵泰科技公司，货号：YT11196）。LncRNA MEG8 引物及甘油醛-3- 磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 内参引物由广州锐博生物公司提供，引物序列：LncRNA MEG8：正向引物5’-TAGGAGTGGATGTG TTCTCTAGCA-3’，反向引物5’-TGGTCGTGGAATA TGGTCAATGAG-3’；GAPDH：正向引物5’-CGGAG TCAACGGATTTGGT CGTAT-3’，反向引物5’-AGC CTTCTCCATGGTGAA GAC-3’。实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）仪（广州辉骏生物公司，型号：CFX384）；NanoDrop ND-12000 超微量分光光度计（美国Thermo 公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本收集：收集所有患者确诊后次日（对照组为体检当日）空腹静脉血3～4ml，自然冷却至室温后进行血清分离，于-20℃冰箱中保存以备检测。

1.3.2 qRT-PCR 法检测血清中LncRNA MEG8 的相对表达水平：根据组织细胞RNA 提取试剂盒、M-MLV 反转录试剂盒说明书对样本进行处理，采用qRT-PCR 法检测LncRNA MEG8 的表达水平。每组实验重复三次，测定LncRNA MEG8 的Ct值，GAPDH 作为内参对待测LncRNA MEG8 进行标准化，使用2-ΔΔCt方法对LncRNA MEG8 的相对表达水平进行分析。

1.3.3 免疫比浊法检测血清CRP 水平：使用免疫比浊法测定血清CRP 水平，按照人CPR ELISA 试剂盒说明书对梯度标准品进行配制，在600 nm 处测定吸光度值，建立吸光度与浓度的工作曲线。于-20℃冰箱中取适量血清样本，解冻，测定各样本的吸光度，计算血清CRP 水平。

1.4 统计学分析 SPSS 25.0 处理数据，计量资料均为正态分布，以均数±标准差（±s）表示，两组数据行t检验，多组数据比较采用单因素方差分析（总体有差异进一步通过SNK-q检验进行两两比较）；计数资料以n（%）表示，行χ2检验；对患者血清中LncRNA MEG8 与CRP 水平的相关性采用Pearson 分析；Spearman 法分析患者LncRNA MEG8 与NIHSS 评分的相关性；对影响缺血性脑卒中发生的因素行Logistic 分析；受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic，ROC）曲线分析LncRNA MEG8 水平诊断缺血性脑卒中的价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组和对照组血清LncRNA MEG8，CRP水平比较 对照组血清LncRNA MEG8，CRP 水平分别为1.01±0.15，4.84±1.21mg/L；观察组血清LncRNA MEG8，CRP 水平分别为1.55±0.31，10.56±2.33mg/L；与对照组相比，观察组血清中LncRNA MEG8，CRP 水平均显著升高，差异有统计学意义（t=14.373，19.957，均P=0.000）。

2.2 血清LncRNA MEG8，CRP 水平、NIHSS 评分与缺血性脑卒中危重程度的关系 见表1。与轻度患者组相比，中度患者组与重度患者组血清LncRNA MEG8 表达水平、CRP 水平随着病情的加重依次显著升高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 不同程度缺血性脑卒中患者血清LncRNA MEG8，CRP 水平比较（±s）

表1 不同程度缺血性脑卒中患者血清LncRNA MEG8，CRP 水平比较（±s）

注：*与轻度患者组相比，q=4.347,8.773,7.233,13.631,均P＜0.05，#与中度患者组相比，q=4.706,6.828,均P＜0.05。

项目轻度患者组（n=25）中度患者组（n=29）重度患者组（n=26）FP LncRNA MEG8 1.26±0.18 1.54±0.27* 1.84±0.48*# 19.262 0.000 CRP（mg/L） 7.09±1.17 10.59±2.29* 13.86±3.49*# 46.451 0.000

2.3 缺血性脑卒中患者血清LncRNA MEG8 与CRP 水平、NIHSS 评分的相关性 缺血性脑卒中患者血清LncRNA MEG8 与CRP 水平、NIHSS 评分均呈正相关（r=0.412，0.488；P=0.0005，0.0003）。

2.4 对影响缺血性脑卒中的因素进行Logistic 回归分析 见表2。以受试者是否发生缺血性脑卒中为因变量，高血压、高脂血症、糖尿病、LncRNA MEG8，CRP 为自变量行Logistic 回归分析，结果显示，高血压、高脂血症、糖尿病、LncRNA MEG8，CRP 是影响缺血性脑卒中的危险因素（均P＜0.05）。

表2 Logistic 回归分析影响缺血性脑卒中的因素

2.5 LncRNA MEG8 对缺血性脑卒中的诊断价值 见图1。ROC 曲线显示，LncRNA MEG8 水平诊断缺血性脑卒中的ROC 曲线下面积为0.923（95%CI:0.880～0.966），截断值为1.14，约登指数为0.754，敏感度和特异度分别为81.3%，94.1%。

图1 LncRNA MEG8 诊断缺血性脑卒中的ROC 曲线

3 讨论

缺血性脑卒中具有较高的发病率和致死率，脑供血障碍可造成永久性残疾[8]。研究发现，缺血性脑卒中与炎症、动脉粥样硬化、凝血和血小板活化等有关，炎症细胞释放的活性氧、自由基、氧化剂等威胁着缺血核心附近组织的生存，影响缺血级联途径，造成缺血核心出现不可逆神经元损伤，一些微小RNA，循环环状RNA，促炎蛋白等生物标志物与血管生成、炎症反应相关，影响缺血性脑卒中的发展[9-11]。因此，寻找与缺血性脑卒中相关基因与蛋白，及时加以干预，在临床医疗中具有较大的现实意义。

LncRNA 是内源性非编码RNA，能够调节血管生成、增殖、凋亡、自噬等过程，参与肿瘤、神经系统、心血管系统等疾病的进展[12-14]。LncRNA MEG8 作为LncRNA 的一种，能够调节血管平滑肌细胞增殖、迁移以及侵袭，在外周血管疾病和心脑血管疾病中具有重要作用[15]。SUI 等[16]研究LncRNA MEG8 与缺血性脑卒中的关系时发现，LncRNA MEG8 下调可以对miR-130a-5p 负调节，影响血管内皮生长因子A 表达，抑制血管生成，进而减轻缺血性脑卒中后的脑缺血。本研究发现，观察组血清中LncRNA MEG8 水平显著高于对照组。提示，LncRNA MEG8 与缺血性脑卒中具有一定的关系。NIHSS 评分是临床评价缺血性脑卒中神经功能缺损的常用工具，评分越高表明神经功能缺损越严重，是衡量脑卒中严重程度的有效指标[17-18]。CRP 是一种促炎蛋白，作为一种炎症指标，在缺血性脑卒中患者血清中表达升高，造成患者缺血性脑卒中风险增加以及轻度脑卒中或短暂性脑缺血发作等不良结果,预示着患者的病情危重程度[19-21]。进一步研究发现，患者LncRNA MEG8 与CRP 水平、NIHSS 评分呈正相关，且患者病情越重，LncRNA MEG8 水平越高。再次说明LncRNA MEG8 与缺血性脑卒中密切相关，可对缺血性脑卒中危重程度进行判断，对其水平检测可协助判断患者病情的危重程度。ZHANG 等[22]发现患者血清LncRNA MEG8水平升高，在妊娠期发生妊娠糖尿病的概率增大，能够作为血清中标志物预测妊娠糖尿病的发生。高水平的LncRNA MEG8 调节血管平滑肌细胞迁移、凋亡，影响血管内皮生长因子表达，促进血管生成，造成缺血性脑卒中，是影响缺血性脑卒中的危险因素。血清LncRNA MEG8 能够对缺血性脑卒中进行诊断，当血清LncRNA MEG8 相对表达水平＞1.14时，临床应及时制定诊疗方案，防止患者病情恶化。

综上，缺血性脑卒中患者LncRNA MEG8 表达显著升高，与CRP 水平、NIHSS 评分均呈正相关，对缺血性脑卒中具有一定的诊断价值。然而LncRNA MEG8 参与缺血性脑卒中发生发展的具体机制仍需进一步探究。