夏慧娟,付小梅,陈秋月(内江市第一人民医院儿科,四川内江 641000)
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是儿童肺炎常见的类型,具有变形性强、直径小等特点,儿童自身抵抗力差,更易引起MP 感染,诱发哮喘,影响生长发育[1-2]。大量研究发现儿童哮喘与MP 感染密切相关,临床上能够有效评估MP 患儿病情,及时调整治疗方案,准确预测患儿预后情况对提高患儿预后生活质量具有重要的意义[3]。miRNAs 参与调控机体各项生理活动,与机体多种疾病的发生发展紧密相关,对维持机体稳定平衡发挥重要调控作用[4-5]。研究发现微小核糖核酸(micro RNA,miR)-424-5p 表达水平与多种疾病发生密切相关,例如卵巢癌、肺癌、结肠癌等,但miR-424-5p 与MP 感染的相关性尚未被深入研究[6-7]。不规则趋化因子人驱动蛋白(CX3CL1)结构特殊,既可以与受体CX3CR1 结合参与细胞间黏附,也可与其他炎性因子协同作用增强细胞间趋化作用[8]。CX3CL1 与其受体CX3CR1 共同作用影响着多种疾病的发生与发展,与多种疾病的发病机制相关[9]。目前,CX3CL1 表达在MP 诱发哮喘发病过程中的作用机制尚未被研究,本研究拟通过检测MP 感染诱发哮喘患儿血清miR-424-5p 和CX3CL1 表达水平变化,分析二者与患儿预后的相关性。
1.1 研究对象 选择2020 年3 月~2021 年5 月在内江市第一人民医院确诊并进行治疗的128 例MP感染患儿,根据是否诱发哮喘分为哮喘组和MP 组。哮喘组82 例,男性44 例,女性38 例,年龄2~9(5.67±0.91)岁;MP 组46 例,男性22 例,女性24 例,年龄3~9(5.49±0.86)岁;对照组为50例健康儿童,男性23 例,女性27 例,年龄2~10(5.75±1.08)岁。三组儿童年龄、性别差异均无统计学意义(χ2/F=0.949,0.846,均P>0.05),收集整理所有患者的临床基本资料。纳入标准:①哮喘组和MP 组患儿经MP 抗体检测均为阳性;②无其它病原体引起的感染;③患儿监护人已了解本次研究,签署知情同意书。排除标准:①支气管发育不良或畸形的患儿;②其它原因引发的哮喘患儿;③伴有其它血液系统疾病者;④伴有严重自身免疫性疾病者。本研究已经过本院医学伦理委员会审核通过。
1.2 仪器与试剂 Trizol 试剂盒(赛默飞世尔科技有限公司);实时荧光定量PCR 试剂盒(武汉默沙克生物科技有限公司);CX3CL1 检测试剂盒(广州奥瑞达生物科技有限公司);IgE,IL-6 和TNF-α 检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司);7500 荧光定量PCR 仪(美国ABI 公司);ReadMax 1900Plus 型光吸收全波长酶标仪(上海闪谱生物科技有限公司);PowerCube 肺功能测试仪(德国GANSHORN 公司)。
1.3 方法
1.3.1 样本采集:采集所有患儿清晨空腹静脉血4~6 ml,4℃,3 500 r/min 离心15 min,分离血清置于-80℃保存备用。
1.3.2 实时荧光定量PCR 法:采用实时荧光定量PCR 方法检测血清中miR-424-5p 相对表达量。使用Trizol 试剂盒提取各组血清中的总RNA,然后将RNA 反转录为cDNA,根据实时荧光定量PCR 试剂盒操作说明进行操作。反应条件:95℃预变性10 min,95℃变性15 s,60℃退火30 s,70℃延伸20 s,共40 个循环。引物序列见表1,以U6 作为内参基因,采用2-△△Ct值表示相对表达水平。
表1 引物序列
1.3.3 酶联免疫吸附法:采用酶联免疫吸附法分别检测血清CX3CL1,免疫球蛋白E(immunoglobulin E,Ig E),白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,严格按照试剂盒操作说明进行检测。
1.3.4 肺功能指标检测:采用肺功能测试仪检测患儿肺活量(VC)、用力肺活量(FVC)和第一秒用力呼气容积(FEV1)指标,各指标测量三次取平均值。
1.3.5 随访观察:所有患儿预后均进行为期12 个月的随访观察,患儿临床特征、体征和CT 检查正常或基本恢复正常的视为预后良好组(n=50),出现复发或其它情况的为预后不良组(n=32)。
1.4 统计学分析 采用SPSS25.0 软件进行数据分析,计数资料以n(%)表示,采用χ2检验;计量资料以均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析,两两比较采用snk-q检验,采用Kaplan-Meier 法分析MP 诱发哮喘患儿血清中miR-424-5p 和CX3CL1 的表达与患儿预后的关系,对数秩检验进行组间生存曲线差异分析,采用多因素Logisitic 回归分析MP 诱发哮喘患儿预后影响因素,P<0.05 为差异具有统计学意义。
2.1 哮喘组、MP 组和对照组血清miR-424-5p,CX3CL1,Ig E,IL 6 和TNF α 水平分析 见表2。对照组、MP 组和哮喘组患儿血清miR-424-5p,CX3CL1,Ig E,IL-6 和TNF-α 表达水平依次升高,且组间比较差异具有统计学意义(均P<0.05)。
表2 哮喘组、MP 组和对照组血清miR-424-5p,CX3CL1,Ig E,IL-6 和TNF-α 水平(±s)
表2 哮喘组、MP 组和对照组血清miR-424-5p,CX3CL1,Ig E,IL-6 和TNF-α 水平(±s)
注:*与对照组相比,t=3.385,8.843,5.839,19.501,14.560; 26.417,19.106,28.324,10.920,18.672,均P<0.05;#与MP 组相比,t=4.859,12.519,9.583,6.400,6.076,均P<0.05。
项目对照组(n=50)MP 组(n=46)哮喘组(n=82)FP miR-424-5p0.95±0.261.12±0.35*1.34±0.39*#20.2870.000 CX3CL1(ng/ml)0.47±0.080.62±0.17*0.91±0.22*#103.2740.000 IgE(IU/ml)22.64±5.7441.26±8.91*52.31±10.26*#174.4700.000 IL-6(ng/L)5.26±0.908.24±1.07*9.14±1.18*#205.3170.000 TNF-α(pg/ml)55.27±10.5488.56±18.67*105.26±26.48*#87.3490.000
2.2 哮喘组、MP 组和对照组肺功能指标分析 见表3。对照组、MP 组和哮喘组患儿肺功能指标VC,FVC 和FEV1 依次下降,且组间比较差异具有统计学意义(均P<0.05)。
表3 哮喘组、MP 组和对照组肺功能指标(±s)
表3 哮喘组、MP 组和对照组肺功能指标(±s)
注:*与对照组相比,t=8.037,14.825,8.353; 15.723,10.653,15.676,均P<0.05;#与MP 组相比,t=5.526,6.051,3.454,均P<0.05。
指标对照组(n=50)MP 组(n=46)哮喘组(n=82)FP VC(ml)80.24±19.3562.35±15.48*51.26±12.38*#54.9430.000 FVC(%)78.35±18.2960.21±16.34*48.36±11.73*#61.8210.000 FEV1(%)63.31±17.2644.26±10.31*38.69±9.58*#63.0060.000
2.3 哮喘组患儿预后与临床病理特征分析 见表4。预后良好组患儿血清Ig E,IL-6,TNF-α,miR-424-5p 和CX3CL1 水平均明显低于预后不良组,差异具有统计学意义(t=3.086~6.137,均P<0.05)。
表4 哮喘组患儿预后与临床病理特征分析[±s,n(%)]
表4 哮喘组患儿预后与临床病理特征分析[±s,n(%)]
类别预后良好组(n=50)预后不良组(n=32)t/χ2P年龄(岁)5.60±0.845.78±0.810.9600.340性别 男23(46.00)21(65.63)3.0220.082女27(54.00)11(34.37)鼻炎史 有26(52.00)18(56.25)0.1420.707无24(48.00)14(43.75)过敏史 有22(44.00)17(53.13)0.6510.420无28(56.00)15(46.87)Ig E(IU/ml)48.32±10.6958.54±13.373.8250.000 IL-6(ng/L)8.51±1.0910.12±1.266.1370.000 TNF-α(pg/ml)98.43±22.41115.92±28.693.0860.003 miR-424-5p1.22±0.321.54±0.404.0030.000 CX3CL1(ng/ml)0.78±0.201.12±0.316.0440.000
2.4 MP 感染诱发哮喘患儿血清miR-424-5p,CX3CL1 表达与患儿预后关系分析 见图1,图2。采用Kaplan-Meier 法分析MP 感染诱发哮喘患儿血清miR-424-5p,CX3CL1 水平与患儿预后的关系,以哮喘患儿血清miR-424-5p,CX3CL1 水平平均值为截断值,血清miR-424-5p ≤1.34 为低表达,>1.34 为高表达;CX3CL1 ≤0.91 ng/ml 为低表达,>0.91 ng/ml 为高表达。结果显示哮喘患儿血清中miR-424-5p 低表达组预后良好率为81.82%,明显高于高表达组预后良好率36.84%(χ2=4.377,P<0.05);哮喘患儿血清中CX3CL1 低表达组预后良好率为79.17%,明显高于高表达组预后良好率35.29%(χ2=4.172,P<0.05)。
图1 哮喘患儿血清miR-424-5p 与预后关系
图2 哮喘患儿血清CX3CL1 与预后关系
2.5 多因素Logisitic 回归分析MP 感染诱发哮喘患儿预后影响因素 见表5。以哮喘患儿预后情况作为因变量(预后良好=0,预后不良=1),以2.3单因素分析结果中具有显著性差异的指标作为自变量,IgE,IL-6,TNF-α,miR-424-5p 和CX3CL1均为连续变量。多因素Logistic 回归分析结果显示,Ig E,IL-6,TNF-α,miR-424-5p 和CX3CL1 水平为MP诱发哮喘患儿预后不良的影响因素(P<0.05)。
表5 多因素Logisitic 回归分析MP 感染诱发哮喘患儿预后影响因素
MP 感染是目前引起儿童肺炎的主要原因,我国5 岁以下儿童获得性肺炎中约7.1%是由MP感染引起的[10]。MP 感染与儿童哮喘发病密切相关,据统计,MP 感染引起的哮喘占儿童哮喘的47.60%[11]。MP 是介于病毒和细菌之间的一种原核微生物,MP 会释放一些引起巨噬细胞以及单核细胞等炎症相关细胞浸润的物质,加重气道炎症反应,引起气道变态反应引发哮喘[12]。MP 感染诱发哮喘患儿机体免疫调节功能紊乱,机体感染MP 后促进炎症因子的释放,引发炎症反应,破坏机体免疫系统,加速病情的发展。研究发现,MP 感染诱发哮喘患儿的血清免疫球蛋白水平异常表达,导致机体免疫功能被抑制,进而引发细胞免疫相关指标水平异常,机体宿主细胞膜抗原结构发生改变,形成免疫复合物,引发机体出现病理损伤[13]。血清IgE 主要在呼吸道黏膜上由B 细胞产生,当机体发生感染时,IgE 表达会显著增高[14]。IL-6 和TNF-α 均为机体炎症相关因子,TNF-α 主要调节人体内环境平衡,机体出现炎症感染时TNF-α 水平会明显升高,IL-6 炎症因子与多种疾病发生与发展密切相关,机体发生炎症反应时IL-6 表达异常,其表达水平随炎症程度变化而变化[15]。刘翠兰等[16]研究报道,MP 感染组哮喘患儿IgE,IL-6 和TNF-α 水平显著高于非MP 感染组和健康儿童,MP 感染组、非MP 感染组和健康儿童肺功能相关指标依次降低,且哮喘发生与血清IgE,IL-6 和TNF-α 水平升高有关。本研究结果显示,哮喘组、MP 感染组和对照组血清IgE,IL-6 和TNF-α 水平依次降低,肺功能相关指标依次升高,其表达水平均为MP 诱发哮喘患儿预后不良的影响因素,提示血清炎症因子IgE,IL-6 和TNF-α 水平与MP 感染诱发哮喘密切相关,与既往研究结果一致。
miRNA 属于内源性,具有调控功能的非编码RNA,通过与靶基因mRNA 的3’-非编码区特异性结合,降解或中断mRNA 的翻译,从而调控基因翻译过程[17-18]。大量研究表明,MP 感染和哮喘都会引起多种miRNA 异常表达,例如miR-492,miR-141-3p 等,miRNA 可通过调控单核巨噬细胞系统免疫炎性因子(IL-6,TNF-α 等)的分泌在MP 感染诱发哮喘病情发展过程中发挥作用[19]。研究发现,miR-424-5p 在多种疾病发生发展过程中异常表达。王梅等[20]研究发现,miR-424-5p 在结直肠癌患者血清中表达异常升高,高水平miR-424-5p与病情发展及不良预后相关。本研究结果显示,MP 组、哮喘组患儿血清miR-424-5p 表达水平显著高于对照组,miR-424-5p 低表达患儿预后良好率显著高于高表达患儿,且miR-424-5p 水平为MP 诱发哮喘患儿预后不良的影响因素,提示miR-424-5p水平与MP 感染诱发哮喘患儿病情发展密切相关,其表达水平影响患儿预后。
CX3CL1 属于CX3C 趋化家族一员,其特异性受体为CX3CR1,CX3CL1 分为膜结合型和分泌型两类,机体内主要发挥黏附和趋化两大作用[21]。CX3CL1 广泛分布于内皮细胞、淋巴细胞等多种细胞组织中,其与CX3CR1 结合刺激炎性因子释放,促使机体炎症反应加重[22]。据报道,CX3CL1 在多种炎症性疾病中过度表达,例如:慢性阻塞性肺疾病,神经炎症和中枢神经系统疾病等,但在哮喘疾病中发挥的作用尚未被研究[23]。梁丽等[24]研究发现,慢性阻塞性肺疾病患者血清中CX3CL1 水平明显升高,其水平变化与病情严重程度相关,可根据其表达水平评价患者预后效果。本研究结果显示,MP 组、哮喘组患儿血清CX3CL1 表达水平显著高于对照组,CX3CL1 低表达患儿预后良好率显著高于高表达患儿,CX3CL1 水平为MP 诱发哮喘患儿预后不良的影响因素,提示CX3CL1 表达水平影响MP 感染诱发哮喘患儿预后情况。
综上所述,MP 感染诱发哮喘患儿血清miR-424-5p 和CX3CL1 表达上调,且表达水平影响患儿预后情况,检测两者表达水平对MP 感染诱发哮喘患儿预后评估具有重要价值。