肺炎支原体感染诱发哮喘患儿血清中miR-424-5p和CX3CL1表达水平及与预后预测价值研究

夏慧娟，付小梅，陈秋月（内江市第一人民医院儿科，四川内江 641000）

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）是儿童肺炎常见的类型，具有变形性强、直径小等特点，儿童自身抵抗力差，更易引起MP 感染，诱发哮喘，影响生长发育[1-2]。大量研究发现儿童哮喘与MP 感染密切相关，临床上能够有效评估MP 患儿病情，及时调整治疗方案，准确预测患儿预后情况对提高患儿预后生活质量具有重要的意义[3]。miRNAs 参与调控机体各项生理活动，与机体多种疾病的发生发展紧密相关，对维持机体稳定平衡发挥重要调控作用[4-5]。研究发现微小核糖核酸(micro RNA,miR)-424-5p 表达水平与多种疾病发生密切相关，例如卵巢癌、肺癌、结肠癌等，但miR-424-5p 与MP 感染的相关性尚未被深入研究[6-7]。不规则趋化因子人驱动蛋白（CX3CL1）结构特殊，既可以与受体CX3CR1 结合参与细胞间黏附，也可与其他炎性因子协同作用增强细胞间趋化作用[8]。CX3CL1 与其受体CX3CR1 共同作用影响着多种疾病的发生与发展，与多种疾病的发病机制相关[9]。目前，CX3CL1 表达在MP 诱发哮喘发病过程中的作用机制尚未被研究，本研究拟通过检测MP 感染诱发哮喘患儿血清miR-424-5p 和CX3CL1 表达水平变化，分析二者与患儿预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2020 年3 月～2021 年5 月在内江市第一人民医院确诊并进行治疗的128 例MP感染患儿，根据是否诱发哮喘分为哮喘组和MP 组。哮喘组82 例，男性44 例，女性38 例，年龄2～9（5.67±0.91）岁；MP 组46 例，男性22 例，女性24 例，年龄3～9（5.49±0.86）岁；对照组为50例健康儿童，男性23 例，女性27 例，年龄2～10（5.75±1.08）岁。三组儿童年龄、性别差异均无统计学意义（χ2/F=0.949,0.846,均P＞0.05），收集整理所有患者的临床基本资料。纳入标准：①哮喘组和MP 组患儿经MP 抗体检测均为阳性；②无其它病原体引起的感染；③患儿监护人已了解本次研究，签署知情同意书。排除标准：①支气管发育不良或畸形的患儿；②其它原因引发的哮喘患儿；③伴有其它血液系统疾病者；④伴有严重自身免疫性疾病者。本研究已经过本院医学伦理委员会审核通过。

1.2 仪器与试剂 Trizol 试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司）；实时荧光定量PCR 试剂盒（武汉默沙克生物科技有限公司）；CX3CL1 检测试剂盒（广州奥瑞达生物科技有限公司）；IgE，IL-6 和TNF-α 检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；7500 荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）；ReadMax 1900Plus 型光吸收全波长酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司）；PowerCube 肺功能测试仪（德国GANSHORN 公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集：采集所有患儿清晨空腹静脉血4～6 ml，4℃，3 500 r/min 离心15 min，分离血清置于-80℃保存备用。

1.3.2 实时荧光定量PCR 法：采用实时荧光定量PCR 方法检测血清中miR-424-5p 相对表达量。使用Trizol 试剂盒提取各组血清中的总RNA，然后将RNA 反转录为cDNA，根据实时荧光定量PCR 试剂盒操作说明进行操作。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，70℃延伸20 s，共40 个循环。引物序列见表1，以U6 作为内参基因，采用2-△△Ct值表示相对表达水平。

表1 引物序列

1.3.3 酶联免疫吸附法：采用酶联免疫吸附法分别检测血清CX3CL1，免疫球蛋白E（immunoglobulin E，Ig E），白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，严格按照试剂盒操作说明进行检测。

1.3.4 肺功能指标检测：采用肺功能测试仪检测患儿肺活量（VC）、用力肺活量（FVC）和第一秒用力呼气容积（FEV1）指标，各指标测量三次取平均值。

1.3.5 随访观察：所有患儿预后均进行为期12 个月的随访观察，患儿临床特征、体征和CT 检查正常或基本恢复正常的视为预后良好组（n=50），出现复发或其它情况的为预后不良组（n=32）。

1.4 统计学分析 采用SPSS25.0 软件进行数据分析，计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，两两比较采用snk-q检验，采用Kaplan-Meier 法分析MP 诱发哮喘患儿血清中miR-424-5p 和CX3CL1 的表达与患儿预后的关系，对数秩检验进行组间生存曲线差异分析，采用多因素Logisitic 回归分析MP 诱发哮喘患儿预后影响因素，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 哮喘组、MP 组和对照组血清miR-424-5p，CX3CL1，Ig E，IL 6 和TNF α 水平分析 见表2。对照组、MP 组和哮喘组患儿血清miR-424-5p，CX3CL1，Ig E，IL-6 和TNF-α 表达水平依次升高，且组间比较差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 哮喘组、MP 组和对照组血清miR-424-5p，CX3CL1，Ig E，IL-6 和TNF-α 水平（±s）

表2 哮喘组、MP 组和对照组血清miR-424-5p，CX3CL1，Ig E，IL-6 和TNF-α 水平（±s）

注：*与对照组相比，t=3.385,8.843,5.839,19.501,14.560; 26.417,19.106,28.324,10.920,18.672,均P＜0.05；#与MP 组相比，t=4.859,12.519,9.583,6.400,6.076,均P＜0.05。

项目对照组（n=50）MP 组（n=46）哮喘组（n=82）FP miR-424-5p0.95±0.261.12±0.35*1.34±0.39*#20.2870.000 CX3CL1（ng/ml）0.47±0.080.62±0.17*0.91±0.22*#103.2740.000 IgE（IU/ml）22.64±5.7441.26±8.91*52.31±10.26*#174.4700.000 IL-6（ng/L）5.26±0.908.24±1.07*9.14±1.18*#205.3170.000 TNF-α（pg/ml）55.27±10.5488.56±18.67*105.26±26.48*#87.3490.000

2.2 哮喘组、MP 组和对照组肺功能指标分析 见表3。对照组、MP 组和哮喘组患儿肺功能指标VC，FVC 和FEV1 依次下降，且组间比较差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表3 哮喘组、MP 组和对照组肺功能指标（±s）

表3 哮喘组、MP 组和对照组肺功能指标（±s）

注：*与对照组相比，t=8.037,14.825,8.353; 15.723,10.653,15.676,均P＜0.05；#与MP 组相比，t=5.526,6.051,3.454,均P＜0.05。

指标对照组（n=50）MP 组（n=46）哮喘组（n=82）FP VC（ml）80.24±19.3562.35±15.48*51.26±12.38*#54.9430.000 FVC（%）78.35±18.2960.21±16.34*48.36±11.73*#61.8210.000 FEV1（%）63.31±17.2644.26±10.31*38.69±9.58*#63.0060.000

2.3 哮喘组患儿预后与临床病理特征分析 见表4。预后良好组患儿血清Ig E，IL-6，TNF-α，miR-424-5p 和CX3CL1 水平均明显低于预后不良组，差异具有统计学意义（t=3.086～6.137，均P＜0.05）。

表4 哮喘组患儿预后与临床病理特征分析[±s，n(%)]

表4 哮喘组患儿预后与临床病理特征分析[±s，n(%)]

类别预后良好组（n=50）预后不良组（n=32）t/χ2P年龄（岁）5.60±0.845.78±0.810.9600.340性别 男23（46.00）21（65.63）3.0220.082女27（54.00）11（34.37）鼻炎史 有26（52.00）18（56.25）0.1420.707无24（48.00）14（43.75）过敏史 有22（44.00）17（53.13）0.6510.420无28（56.00）15（46.87）Ig E（IU/ml）48.32±10.6958.54±13.373.8250.000 IL-6（ng/L）8.51±1.0910.12±1.266.1370.000 TNF-α（pg/ml）98.43±22.41115.92±28.693.0860.003 miR-424-5p1.22±0.321.54±0.404.0030.000 CX3CL1（ng/ml）0.78±0.201.12±0.316.0440.000

2.4 MP 感染诱发哮喘患儿血清miR-424-5p，CX3CL1 表达与患儿预后关系分析 见图1，图2。采用Kaplan-Meier 法分析MP 感染诱发哮喘患儿血清miR-424-5p，CX3CL1 水平与患儿预后的关系，以哮喘患儿血清miR-424-5p，CX3CL1 水平平均值为截断值，血清miR-424-5p ≤1.34 为低表达，＞1.34 为高表达；CX3CL1 ≤0.91 ng/ml 为低表达，＞0.91 ng/ml 为高表达。结果显示哮喘患儿血清中miR-424-5p 低表达组预后良好率为81.82%，明显高于高表达组预后良好率36.84%（χ2=4.377，P＜0.05）；哮喘患儿血清中CX3CL1 低表达组预后良好率为79.17%，明显高于高表达组预后良好率35.29%（χ2=4.172，P＜0.05）。

图1 哮喘患儿血清miR-424-5p 与预后关系

图2 哮喘患儿血清CX3CL1 与预后关系

2.5 多因素Logisitic 回归分析MP 感染诱发哮喘患儿预后影响因素 见表5。以哮喘患儿预后情况作为因变量（预后良好=0，预后不良=1），以2.3单因素分析结果中具有显著性差异的指标作为自变量，IgE，IL-6，TNF-α，miR-424-5p 和CX3CL1均为连续变量。多因素Logistic 回归分析结果显示，Ig E，IL-6，TNF-α，miR-424-5p 和CX3CL1 水平为MP诱发哮喘患儿预后不良的影响因素（P＜0.05）。

表5 多因素Logisitic 回归分析MP 感染诱发哮喘患儿预后影响因素

3 讨论

MP 感染是目前引起儿童肺炎的主要原因，我国5 岁以下儿童获得性肺炎中约7.1%是由MP感染引起的[10]。MP 感染与儿童哮喘发病密切相关，据统计，MP 感染引起的哮喘占儿童哮喘的47.60%[11]。MP 是介于病毒和细菌之间的一种原核微生物，MP 会释放一些引起巨噬细胞以及单核细胞等炎症相关细胞浸润的物质，加重气道炎症反应，引起气道变态反应引发哮喘[12]。MP 感染诱发哮喘患儿机体免疫调节功能紊乱，机体感染MP 后促进炎症因子的释放，引发炎症反应，破坏机体免疫系统，加速病情的发展。研究发现，MP 感染诱发哮喘患儿的血清免疫球蛋白水平异常表达，导致机体免疫功能被抑制，进而引发细胞免疫相关指标水平异常，机体宿主细胞膜抗原结构发生改变，形成免疫复合物，引发机体出现病理损伤[13]。血清IgE 主要在呼吸道黏膜上由B 细胞产生，当机体发生感染时，IgE 表达会显著增高[14]。IL-6 和TNF-α 均为机体炎症相关因子，TNF-α 主要调节人体内环境平衡，机体出现炎症感染时TNF-α 水平会明显升高，IL-6 炎症因子与多种疾病发生与发展密切相关，机体发生炎症反应时IL-6 表达异常，其表达水平随炎症程度变化而变化[15]。刘翠兰等[16]研究报道，MP 感染组哮喘患儿IgE，IL-6 和TNF-α 水平显著高于非MP 感染组和健康儿童，MP 感染组、非MP 感染组和健康儿童肺功能相关指标依次降低，且哮喘发生与血清IgE，IL-6 和TNF-α 水平升高有关。本研究结果显示，哮喘组、MP 感染组和对照组血清IgE，IL-6 和TNF-α 水平依次降低，肺功能相关指标依次升高，其表达水平均为MP 诱发哮喘患儿预后不良的影响因素，提示血清炎症因子IgE，IL-6 和TNF-α 水平与MP 感染诱发哮喘密切相关，与既往研究结果一致。

miRNA 属于内源性，具有调控功能的非编码RNA，通过与靶基因mRNA 的3’-非编码区特异性结合，降解或中断mRNA 的翻译，从而调控基因翻译过程[17-18]。大量研究表明，MP 感染和哮喘都会引起多种miRNA 异常表达，例如miR-492，miR-141-3p 等，miRNA 可通过调控单核巨噬细胞系统免疫炎性因子（IL-6，TNF-α 等）的分泌在MP 感染诱发哮喘病情发展过程中发挥作用[19]。研究发现，miR-424-5p 在多种疾病发生发展过程中异常表达。王梅等[20]研究发现，miR-424-5p 在结直肠癌患者血清中表达异常升高，高水平miR-424-5p与病情发展及不良预后相关。本研究结果显示，MP 组、哮喘组患儿血清miR-424-5p 表达水平显著高于对照组，miR-424-5p 低表达患儿预后良好率显著高于高表达患儿，且miR-424-5p 水平为MP 诱发哮喘患儿预后不良的影响因素，提示miR-424-5p水平与MP 感染诱发哮喘患儿病情发展密切相关，其表达水平影响患儿预后。

CX3CL1 属于CX3C 趋化家族一员，其特异性受体为CX3CR1，CX3CL1 分为膜结合型和分泌型两类，机体内主要发挥黏附和趋化两大作用[21]。CX3CL1 广泛分布于内皮细胞、淋巴细胞等多种细胞组织中，其与CX3CR1 结合刺激炎性因子释放，促使机体炎症反应加重[22]。据报道，CX3CL1 在多种炎症性疾病中过度表达，例如：慢性阻塞性肺疾病，神经炎症和中枢神经系统疾病等，但在哮喘疾病中发挥的作用尚未被研究[23]。梁丽等[24]研究发现，慢性阻塞性肺疾病患者血清中CX3CL1 水平明显升高，其水平变化与病情严重程度相关，可根据其表达水平评价患者预后效果。本研究结果显示，MP 组、哮喘组患儿血清CX3CL1 表达水平显著高于对照组，CX3CL1 低表达患儿预后良好率显著高于高表达患儿，CX3CL1 水平为MP 诱发哮喘患儿预后不良的影响因素，提示CX3CL1 表达水平影响MP 感染诱发哮喘患儿预后情况。

综上所述，MP 感染诱发哮喘患儿血清miR-424-5p 和CX3CL1 表达上调，且表达水平影响患儿预后情况，检测两者表达水平对MP 感染诱发哮喘患儿预后评估具有重要价值。