miR-106b介导RANKL/RANK/OPG通路抗骨质疏松症的实验研究

王正君， 白马恒

(1.陕西省榆林市急救指挥调度中心业务科, 陕西 榆林 7190002.陕西省榆林市星元医院骨科， 陕西 榆林 719000)

骨质疏松症是一种常见全身性骨骼疾病，多发于老年人群，其特征包括骨量减少、骨脆性增加、骨组织结构退化等[1]。在我国，骨质疏松症发病率呈逐年上升趋势，在常见病中位居第5[2]。近年基于微小核糖核酸(miRNA)的靶向基因疗法在骨骼相关疾病中显示出良好的开发前景。miR-106b可调节骨髓间充质干细胞的成骨分化，在骨骼代谢中发挥重要作用。既往研究证实[3]，核因子κB受体激活因子配体(RANKL)/核因子κB受体激活因子(RANK)/骨保护素(OPG)信号通路可调节骨吸收与骨生成的平衡，且此通路的异常激活与骨质疏松症的发生密切相关。据研究报道[4]，miR-106b可通过下调软骨细胞丙酮酸脱氢酶激酶(PDK4)表达，影响RANKL/RANK/OPG通路，但其是否可直接调控RANKL/RANK/OPG通路抗骨质疏松症尚不明确。本研究通过建立骨质疏松症大鼠模型，探讨miR-106b介导RANKL/RANK/OPG通路对骨质疏松症的治疗作用和可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物和细胞：Wistar雌性大鼠70只，6月龄，体质量(280±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0011]。遵循减少、替代和优化原则设计实验。人胚肾细胞293T细胞购自中科院上海细胞库。

1.2主要试剂和仪器：miR-106b mimics-NC、miR-106b mimics、miR-106b inhibitor-NC和miR-106b inhibitor均由广州锐博生物科技有限公司设计并合成；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司(货号：15596026)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司(货号：G1120)；兔抗鼠RANKL、RANK、OPG、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体，二抗均购自美国Thermo Fisher公司(货号：PA5-110268，PA5-80144，PA5-86053，PA1-16777；31460，G-21234，65-6120，32460)；双荧光素酶报告基因试剂盒购自美国Promega公司(货号：E1910)；RAD SPEED-M型X线机购自日本株式会社岛津制作所；Axio Imager 2光学显微镜购自北京普瑞赛司仪器有限公司；JC-TG-16R台式离心机购自青岛聚创环保集团有限公司；C1000 Touch荧光定量聚合酶链式反应(PCR)仪购自美国Bio-Rad公司；Mini-PROTEAN®蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3方 法

1.3.1建模、分组和转染:取60只Wistar大鼠，腹腔注射40mg/kg戊巴比妥钠致其麻醉。沿大鼠腰背椎侧正中切口，切除双侧卵巢；另10只大鼠仅切除卵巢旁脂肪组织作为假手术组[5]。正常饲养8周后，造模大鼠阴道涂片检查未见成熟脱落上皮细胞，且无规律动情变化，X线片显示股骨骨质变薄，骨纹理稀疏，提示骨质疏松症大鼠模型建立成功。51只大鼠建模成功，成功率85%。建模成功的大鼠随机分为模型组(11只)、miR-106b mimics-NC组(10只)、miR-106b mimics组(10只)、miR-106b inhibitor-NC组(10只)、miR-106b inhibitor组(10只)。除模型组外其余各组分别转染miR-106b模拟物阴性对照、miR-106b模拟物、miR-106b抑制剂阴性对照和miR-106b抑制剂，具体转染方法：建模成功7d后向大鼠皮下注射对应的200μL含转染试剂的核酸溶液，每周1次，连续4周。

1.3.2X线骨密度仪检测大鼠股骨骨密度:采用双能X线骨密度仪，扫描大鼠两侧股骨，测骨密度。

1.3.3HE染色观察大鼠右侧股骨组织病理学变化:颈椎脱臼法处死大鼠，分离大鼠右侧股骨组织，常规固定、脱水、包埋、切片、脱蜡，苏木素、伊红依次染色，脱水、透明、封片，光镜下观察病理学变化。

1.3.4实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测大鼠右侧股骨组织miR-106b表达、RANKL、RANK、OPG信使核糖核酸(mRNA)表达:取大鼠右侧股骨组织，Trizol法提取总RNA。逆转录得到互补脱氧核糖核酸(cDNA)，反应体系20μL。反应程序：94℃ 5min，94℃ 45s，60℃ 30s，72℃ 45s，45个循环。miR-106b检测以U6为内参，RANKL、RANK和OPG检测以GAPDH为内参。2-△△Ct法计算各基因相对表达量。引物序列见表1。

1.3.5免疫印迹(WB)检测大鼠右侧股骨组织RANKL、RANK、OPG蛋白表达:取大鼠右侧股骨组织，提取总蛋白，蛋白变性，上样电泳，转膜，封闭，加一抗4℃孵育过夜，洗膜，加二抗室温孵育1h，洗膜，电化学发光液显影。Image J软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参计算目的蛋白相对表达量。

1.3.6双荧光素酶报告基因实验验证miR-106b和RANKL的靶向关系:Target scan网站预测miR-106b和RANKL的结合位点，构建插入野生型(WT)、突变型(Mut)RANKL的双荧光素酶报告质粒，将报告质粒与miR-106b mimics或miR-106b mimics-NC共转染至293T细胞，双荧光素酶报告基因实验检测试剂盒测内参基因、报告基因发光值。

表1 引物序列

2 结 果

2.1各组大鼠股骨骨密度:转染期间各组大鼠均未发现排异反应。与假手术组比，模型组股骨骨密度降低(P<0.05)；与miR-106b mimics组比，模型组、miR-106b mimics-NC组股骨骨密度下降(P<0.05)；与模型组、miR-106b inhibitor-NC组比，miR-106b inhibitor组股骨骨密度降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠股骨骨密度比较

2.2各组大鼠右侧股骨组织病理学变化:假手术组骨小梁排列紧密、厚度均匀。模型组、miR106b mimics-NC组、miR106b inhibitor-NC组骨细胞数明显减少，骨小梁间隙较大，排列紊乱。miR106b mimics组骨细胞数明显增多，排列较紧密，骨小梁厚度增加。miR106b inhibitor组骨细胞数缺失，骨小梁间隙极大，排列紊乱。见图1。

图1 大鼠右侧股骨组织HE染色(×200)

2.3各组大鼠右侧股骨组织miR-106b表达、RANKL、RANK、OPG mRNA表达:与假手术组比，模型组右侧股骨组织RANKL mRNA表达升高(P<0.05)，miR-106b表达和OPG mRNA表达降低(P<0.05)；与模型组、miR-106b mimics-NC组比，miR-106b mimics组右侧股骨组织RANKL mRNA表达降低(P<0.05)，miR-106b表达和OPG mRNA表达升高(P<0.05)；与模型组、miR-106b inhibitor-NC组比，miR-106b inhibitor组右侧股骨组织RANKL mRNA表达升高(P<0.05)，miR-106b表达和OPGmRNA表达降低(P<0.05)；各组大鼠右侧股骨组织RANK mRNA表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 各组大鼠右侧股骨组织RANKL RANK OPG mRNA表达

2.4各组大鼠右侧股骨组织RANKL、RANK、OPG蛋白表达:与假手术组比，模型组右侧股骨组织RANKL蛋白表达升高(P<0.05)，OPG蛋白表达降低(P<0.05)；与模型组、miR-106b mimics-NC组对比，miR-106b mimics组右侧股骨组织RANKL蛋白表达降低(P<0.05)，OPG蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组、miR-106b inhibitor-NC组比，miR-106b inhibitor组右侧股骨组织RANKL蛋白表达升高(P<0.05)，OPG蛋白表达降低(P<0.05)；各组大鼠右侧股骨组织RANK蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 各组大鼠右侧股骨组织RANKL RANK OPG蛋白表达

2.5双荧光素酶报告基因验证miR-106b和RANKL靶向关系:Target scan网站预测结果显示，miR-106b可以结合RANKL的3'-UTR区域，见图2A。在转染野生型RANKL细胞中，miR-106b mimics组细胞相对荧光强度低于miR-106b mimics-NC组细胞，差异有统计学意义(P<0.05)；在转染突变型RANKL细胞中，miR-106b mimics组和miR-106b mimics-NC组细胞相对荧光强度差异无统计学意义(P>0.05)，见图2B。

图2 A miR-106b和RANKL靶向关系；B双荧光素酶报告基因实验验证结果

与miR-106b mimics-NC组比，*P<0.05

3 讨 论

骨质疏松症的发生涉及年龄、遗传因素、性别、女性绝经、激素、生活方式及营养状态等因素[6]。正常的骨代谢依赖于骨重建平衡，骨吸收增加或骨形成减少均引起骨量丢失、骨强度不足，进而导致骨质疏松症的发生[7]。因此，研究骨质疏松症的新靶点、新疗法具有重要意义。

miRNA可在转录后水平调控基因的表达，参与多种生理、病理过程[8]。Ménard C等[9]研究发现，miR-106b可抑制病理性视网膜血管生成。Yu B等[10]研究表明，抑制miR-106b表达可抑制磨损碎片诱导的大鼠假体周围骨溶解的炎性骨破坏。本研究建立骨质疏松症大鼠模型，为观察miR-106b过表达、miR-106b低表达对骨质疏松的影响设置miR-106b mimics组、miR-106b inhibitor组，同时为避免干扰因素的影响另设置miR-106b mimics-NC组、miR-106b inhibitor-NC组；各组转染后发现miR-106b mimics组miR-106b表达最高，假手术组miR-106b表达次之，模型组、miR-106b mimics-NC组、miR-106b inhibitor-NC组表达稍低，miR-106b inhibitor组表达最低，证实转染成功；miR-106b mimics组大鼠股骨骨密度升高，骨细胞数增多，排列紧密，骨小梁厚度增加；miR-106b inhibitor组大鼠股骨骨密度降低，骨细胞数缺失，排列紊乱，骨小梁间隙较大，提示miR-106b可增加骨质疏松症大鼠股骨骨密度，减轻右侧股骨组织病理损伤。

RANKL是破骨前体细胞分化、成熟的必需因子，可增强破骨细胞活性，抑制破骨细胞凋亡[11]。OPG是调节骨代谢的关键因子。RANKL通过与破骨前体细胞、破骨细胞膜受体RANK结合，发挥加快骨质吸收、溶解的作用；同时，成骨细胞分泌OPG，与RANK竞争性结合RANKL，抑制破骨前体细胞分化、成熟，降低破骨细胞活性，调节骨吸收与骨形成间的平衡[12]。Wang X等[13]研究表明，香叶甲素可通过调节RANKL/RANK/OPG信号通路对糖皮质激素诱导的骨质疏松症大鼠发挥骨保护作用。本研究结果显示，miR-106b mimics组大鼠右侧股骨组织RANKL mRNA、蛋白表达降低，OPG mRNA、蛋白表达升高；miR-106b inhibitor组大鼠右侧股骨组织RANKL mRNA、蛋白表达降低，OPG mRNA、蛋白表达升高；双荧光素酶报告基因结果显示miR-106b直接靶向RANKL。上述结果提示miR-106b可靶向调控RANKL的表达，从而抑制RANKL/RANK/OPG信号通路。而关于miR-106b靶向RANKL通路影响成骨细胞增殖和分化的结论已有文献资料报道[14]证实，本研究结果与上述报道一致，再次证实miR-106b可直接靶向RANKL从而可以防治骨质疏松症。

综上所述，上调miR-106b表达可增加骨质疏松症大鼠股骨骨密度，减轻右侧股骨组织病理损伤，可能与抑制RANKL表达，促进OPG表达有关，为骨质疏松症的临床治疗研究提供了新思路。