骨细胞网络结构对骨形成和骨吸收的影响

陈晨 张刚 谷铭勇 李宗玉 桑成林 左贵来

1.中国人民解放军济南军区总医院，骨创科 250031 2.山东大学附属山东省千佛山医院，骨科 250014

骨骼是一种动态的、独特的矿化结缔组织[1]。在人类的一生中要通过持续的塑形(modeling)和再塑形(remodeling)来维护和保障骨组织的健康。骨的塑形主要是指儿童和青少年时期骨骼生长发育的过程，骨的再塑形则是指一生中骨组织持续更新的过程，主要包括骨吸收和骨形成。要维护正常健康的骨组织，需要相互协调并且平衡的骨形成、骨吸收过程[2, 3]。通过骨的再塑形过程可以调整骨组织的结构和密度，应用最少的骨组织达即可达到最大的强度而满足人体的生理需要。就如同一百年前沃尔夫描述的那样，作用在骨骼上的力决定了它们的结构[4]。骨骼塑形和再塑形的过程是由基本多细胞单位(BMU)完成的，实际上也有很多种其他细胞参与这个过程。在骨的多细胞单位(BMU)中破骨细胞负责骨的吸收而成骨细胞负责骨质吸收后的骨形成，在生理状态下两者处于精准的平衡状态。但是到底是何种细胞调节了这个精准的配合过程，至今不是很清楚。随着对骨细胞的而研究的深入，越来越多的实验证据表明骨细胞可能是调节这一过程的关键因素。

骨细胞被人们所认识主要是因为他的形态和埋藏在矿化的基质中，而非是他的功能。因为直到最近10年我们一直未能对这类细胞的特征和其在骨组织中所起到的作用有一个清晰的认识[5]。尽管其在成年个体骨组织中占到所有细胞的95%以上，并且这个比例随着年龄和骨组织体积的增加而增加。骨细胞位于矿化的基质中的骨陷窝(lacuna)中，它们每个细胞大约伸出40 -100个细胞突起(dendritic processes)。细胞突起在矿化的骨组织中形成的细小通道称为骨小管(canaliculi)。骨细胞和骨陷窝-骨小管形成骨细胞-骨陷窝骨小管系统[6, 7]。大量研究证据表明骨细胞是直接调控成骨细胞(Osteoblast)和破骨细胞(Osteoclast)完成再塑形的关键力学感应细胞，是我们研究骨塑形和骨重塑过程中所不能忽视的细胞[8-10]。

1 骨细胞对骨形成的作用

骨细胞在生理状态下对骨形成的影响还有争议的。应用白喉毒素删除体内的骨细胞时骨形成急剧下降，说明骨细胞影响骨形成。但是骨形成的降低可能是由于骨细胞坏死引起的继发性炎症引起的，因为实验证实成骨细胞的成熟在白喉毒素受体阳性的小鼠中是受到抑制[8-10]。与此相反的是骨细胞密度和骨形成呈负相关，随着年龄的增加骨陷窝的空陷窝率和骨膜骨形成率都会增加，提示这两者可能存在着某些联系。在携带变异的Col1a1胶原的小鼠(可以抵抗type I collagen 降解)中，2周时发现骨细胞的空陷窝增加，而后空陷窝增加一直持续增加到10-12月龄。然而在 3-12月龄颅骨骨外膜和胫骨/股骨的骨内膜骨沉积率增加[8]。此外在敲除骨细胞的Gja1的小鼠在骨外膜(periosteal)和内皮质骨(endocortical surfaces)表面的骨形成率增加，而活性骨细胞在这个区域消失[12]。在4月龄的BCL2转基因小鼠中，在骨细胞网络结构被破坏的情况下骨小梁和皮质骨的骨形成增加，尽管这个结果不能完全排除在成骨细胞过度表达BCL2对骨形成的影响[13]。在激活HIF的转基因鼠中发现骨量在3周持续增加，直到8月龄时骨量的持续增加导致骨髓腔几乎完全闭合，与骨量持续增加相伴随的是骨细胞的形态，功能发生变化；骨细胞的凋亡持续增加，到8月龄时骨细胞的中的70%几乎因为凋亡而变成空陷窝。结合以上的转基因小鼠的模型来看骨细胞密度和骨形成呈负相关，在生理条件下骨细胞网络抑制骨的形成[14]。

SOST(骨硬化蛋白)是由骨细胞特异性表达并且通过结合拮抗低密度脂蛋白共受体5和/或者6(LRP 5 和/或 LRP6)抑制成骨细胞的功能，进而抑制骨的形成，是骨形成重要的负性调控因子。在SOST敲除的小鼠中骨小梁和皮质骨的骨膜成骨(periosteal surfaces)和皮质骨内成骨(endocortical surfaces)都增加。此外在骨细胞中特异性的敲除PTH受体后SOST的表达升高，而特异性的持续表达PTH受体后SOST表达下降，因此SOST可能参与了PTH的合成[9]。这说明SOST是一个由骨细胞合成重要的参与成骨细胞分化和功能的调节因子。由于SOST通过骨细胞骨陷窝骨小管网络结构传播，而且没有信号可以通过没有骨细胞的骨陷窝。而在敲除Vhl激活HIF信号通过的小鼠中，骨细胞骨陷窝骨小管网络结构系统破坏，他们之间的联系大为减少，而且空陷窝明显增加。并且在骨细胞内其自身表达SOST的量同时也下降。然而在敲除Vhl激活HIF信号通过的小鼠中的骨小梁和皮质骨骨膜表面和皮质骨内表面的成骨都增强。由此可以判断骨细胞可以通过扩散SOST作为抑制的化学到达骨膜或者皮质骨内表面从而抑制成骨[14]。

除了通过SOST等化学信号连接以外，令人感兴趣的是Kamioka等的工作，认为一些骨细胞的突起的延伸超越成骨细胞层，直接建立骨细胞结构网络和骨髓腔之间的联系[15]。通过这些树突在骨细胞网络结构和骨髓腔之建立起可能的直接联系。Veno PA等使用活细胞成像的方法研究表明骨细胞尤其是那些刚刚包埋进的骨细胞可以伸出或者收缩他们的树突装突起，不仅和别的骨细胞和成骨细胞接触也可以进入骨髓腔[16]。这表明骨细胞有能力建立或者打破与别的细胞系的连接。但是最新的研究证实骨基质中的骨细胞的细胞突起对G-CSF刺激的造血干细胞动员之间有关[17]，而以osterix为启动子敲除Vhl激活HIF信号通过的文章报道，在激活HIF的小鼠外周血中红细胞大量增加[18],这可能的原因是由于骨细胞突起的减少而导致和骨髓腔联系的联系减少[19]。

2 骨细胞对骨吸收的作用

早期的研究者观察体外培养的鸡骨细胞(isolated avian osteocytes)发现，骨细胞可以促进破骨细胞的形成和激活，从而得出骨细胞可以发出信号促进骨吸收这一观点[20]。这个现象在随后的骨样细胞系MLO-Y4中得到证实[20]，但另外一些实验室的研究并没有观察到这个现象，与此同时来源于MLO-Y4的条件性培养液同时促进成骨细胞的分化[22]，也可以促进间充质干细胞的增殖和成骨方向分化[23]。传统的观点认为激活破骨细胞的RANKL主要来源于成骨细胞，但是最新的体外研究证实埋藏于骨基质的骨细胞才是调控破骨细胞形成的RANKL的来源，在骨基质的吸收过程中起到至关重要的作用，应用DMP-1 Cre条件性的敲除骨细胞的RANKL后，转基因鼠的骨量增加[24, 25]。

现在越来越多的研究者认为骨细胞丢失的同时可能也失去了对骨吸收的抑制[26-28]，骨细胞死亡后骨吸收增加，在生理条件下骨细胞一直被认为是抑制骨吸收的[26-28]。一个典型的例子就是应用白喉毒素删除体内的骨细胞[11]。转基因小鼠表达DMP控制之下的白喉毒素受体，然后注射白喉毒素，导致骨吸收的大量增加和严重的骨质疏松。DMP-1表达于成骨细胞开始埋于骨基质时，高峰表达于未成熟骨细胞，在成熟骨细胞表达下降[11]。由白喉毒素原发性或者继发性引起的坏死，骨细胞内的细胞成分从骨陷窝中释放出来，到达骨表面或者血管促进破骨细胞的生成促进修复过程。这似乎是因为注射白喉毒素后高表达RANKL。尽管骨细胞死亡诱导骨吸收，但是是否活的骨细胞抑制骨吸收一直不是很清楚。

然而骨组织中并不存在一个可以被骨细胞本质性抑制的已经分化好的破骨细胞池(a pool of differentiated osteoclasts)。相反破骨细胞是根据具体的需要、由循环系统中的单核细胞分化而来的[32, 33]，而这些分化信号的传递则是通过骨细胞的网络结构系统[5，34]。Gja1是重要的缝隙连接蛋白，在成骨细胞功能和成骨细胞生成方面起到重要作用。敲除骨细胞的Gja1导致骨细胞之间的缝隙连接受损，然而仍然通过骨小管网络保持联系[12]。在Gja1的转基因鼠的模型中，可以观察到由于皮质骨内表面的破骨细胞增加而导致的骨髓腔增宽。这可能暗示在条件性的基因敲除鼠中，骨细胞的凋亡可能诱导骨吸收。而这可能是因为死亡的骨细胞释放细胞内的物质通过未受损的骨小管网络结构触发破骨细胞的形成和骨质吸收。皮质骨髓腔内的破骨前体细胞和免疫细胞可能促进骨细胞死亡后皮质骨内表面破骨细胞的生成。另外一种骨细胞网络结构障碍的动物模型是成骨细胞敲除BCL2的转基因小鼠。BCL2转基因小鼠可能是由于BCL2具有改变细胞骨架结构的功能从而导致了骨细胞突起的数目的减少[12]。细胞逐渐由凋亡而死亡，在4月龄时Tunnel阳性细胞达到80%。然而在BCL2转基因鼠并未因为骨细胞的凋亡而引起骨吸收的增加，与此同时由于小管数量的减少和骨细胞的凋亡增加而引起细胞内外的网络结构的改变。在BCL2转基因并没有增强骨吸收可能是骨小管网络结构的异常，死亡的骨细胞内的结构物质不能释放到骨组织表面和血管。

3 骨细胞的内分泌功能

考虑到骨细胞深埋于矿化的骨基质中，似乎远离其他细胞和器官，把骨细胞归类于内分泌细胞似乎是一件很反常的事情。 但是实际上在骨陷窝骨小管系统(lacunocanalicular system)里流动的骨小管细胞间质液(canalicular fluid)可以反应出骨组织循环的组成，骨细胞和激素、血液系统中各种循环因子的联系。通过骨硬组织切片在激光共聚焦下的观察也也证实了骨小管系统可以直接和血管相互连接[39]。通过小鼠的尾静脉注射普施安红(procion red)，经过短暂的几分钟红色就可以循环扩散到骨细胞-骨陷窝骨小管系统，研究证实最大70KD 的物质可以很容易的从血液系统到达骨陷窝骨小管中。这种骨小管细胞间质液和血液系统的联系使得骨细胞可以暴露于远离器官分泌的循环激素中，同时也为骨细胞分泌的激素和其他蛋白调节介质进入循环系统作用于远离靶器官(distant target organs)提供了通道。

最近一个非常令人振奋的是发现骨细胞可以产生内分泌因子，所以与之相适应的骨细胞网络结构(osteocyte network)应该被视为一种内分泌组织，并且发现其在调节机体磷的代谢中起到至关重要的作用。在2000年被发现以来，FGF23一直被视为骨细胞最重要的内分泌因素[40]。FGF23最初在丘脑的腹外侧核被发现，但是骨组织的含量最高，主要是由骨细胞产生[41, 42]，尤其是在低磷血症的时候含量增加。FGF23的一个重要靶器官是肾脏。骨组织和肾脏之间的信号主要取决于循环水平的FGF23的含量，在维持血清磷水平中起到至关重要的作用。FGF23主要降低肾脏中钠磷协同转运蛋白的NaPi-IIa和 NaPi-IIc的表达，从而抑制肾脏中磷的重吸收。此外过量的FGF23降低1α羟化酶的表达，抑制25羟化维生素D羟化， 使 25(OH)D不能转化成1，25(OH)2D[41]。这种肠腔中1，25(OH,)2D的减少将影响NaPi-IIb表达，使得小肠中磷的吸收减少，导致低磷血症[43]。这种骨细胞和肾脏之间的作用是双向的，1,25(OH)2D 在小鼠模型和细胞培养模型中诱导骨细胞FGF23的表达[44]，这意味着在骨细胞和肾脏之间可能存在着负反馈效应。

基因打靶技术，尤其是特异性的骨细胞条件性敲除小鼠，揭示了骨细胞对于骨形成和骨吸收的重要作用。尽管这些技术只是揭示了骨细胞的某一个基因在骨代谢中的作用，整体骨细胞网络结构的功能远没有阐述清楚，但是依据骨细胞网络结构破坏的小鼠动物模型的组织学研究，骨细胞网络结构在骨代谢方面的功能逐渐清晰。在生理条件下骨细胞网络结构通过激活破骨细胞促进骨吸收，通过抑制成骨细胞抑制骨形成。骨细胞网络结构对骨量是一个负反馈的作用，而力学刺激可以抑制这种反馈信号，使得骨量增加。