CircBIRC6调节miR-126-5p/JARID2轴对非小细胞肺癌细胞顺铂耐药性的影响

党 乙， 张 梁， 翟恒钰， 李文海

(西安国际医学中心医院胸外科, 陕西 西安 710100)

非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要病理类型，化疗是其治疗手段之一，顺铂(Cisplatin，DDP)可与基因组DNA或线粒体DNA结合，阻止DNA复制，抑制细胞增殖，最终诱导细胞坏死或凋亡，但长期使用易发生耐药性，导致患者生存率下降，因此，研究NSCLC的耐药机制，寻找克服肿瘤耐药方法对改善患者预后有重要意义[1]。研究显示，CircBIRC6在NSCLC中表达上调，通过抑制miR-145表达促进NSCLC进展[2]，CircBIRC6是否与NSCLC耐药性有关尚不清楚。miR-126-5p参与结肠癌、上皮性卵巢癌等肿瘤的耐药性[3]，研究显示，miR-126-5p在DDP耐药的NSCLC组织中表达下调，过表达miR-126-5p可靶向并负调控ADAM9表达，提高NSCLC对DDP的敏感性[4]。经starbase在线分析显示，CircBIRC6与miR-126-5p有靶向结合位点，CircBIRC6是否通过调控miR-126-5p表达参与NSCLC细胞的DDP耐药性尚不清楚，本研究探索CircBIRC6对NSCLC细胞DDP耐药作用及机制，为临床克服NSCLC对DDP耐药性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要材料:A549及A549/DDP细胞购于中科院上海细胞库；DDP(1763258)购自美国Sigma公司；CircBIRC6过表达载体(pcBIRC6)及对照(pcDNA)、CircBIRC6干扰质粒(si-CircBIRC6)及阴性对照(si-NC)、miR-126-5p抑制物(miR-126-5p inhibitor)及其对照(NC inhibitor)、各引物购自上海吉玛生物科技有限公司；Lipofectamine 6000转染试剂(C0526)、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(RG089S)、CCK-8试剂盒(C0037)、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(C1062L)购自Beyotime生物；兔抗JARID2(13594)、Cyclin D1(55506)、P21(2947)、P-gp(13978)抗体购自CST公司。

1.2标本来源:选择2015年1月至2017年12月在本院接受手术并进行DDP化疗的NSCLC患者肺癌组织，其中DDP敏感组织23例，DDP耐药组织25例。根据最后一次DDP化疗与患者复发之间的时间间隔，超过6个月为DDP敏感，小于6个月为DDP耐药。本研究经本院伦理委员会批准，患者均知情并签署知情同意书。

1.3方 法

1.3.1细胞培养与转染:A549/DDP细胞在5.0μmoL/L的培养基中进行培养，待A549/DDP细胞培养融合至65%～70%时，使用Lipofectamine 6000转染试剂盒对A549/DDP细胞进行转染，根据转染质粒将细胞分为pcDNA组、pcBIRC6组、si-CircBIRC6组、si-NC组、si-BIRC6+inhibitor NC组，si-BIRC6+miR-126-5p inhibitor组，另设对照组(Control组)不做转染，转染48h后，进行后续实验。

1.3.2A549、A549/DDP细胞对DDP的半抑制浓度:将A549及各组处理的A549/DDP细胞2×104个/孔接种于96孔板中，分别使用终浓度为1、10、20、40、80、160μmoL/L的DDP处理细胞，培养48h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，测定酶标仪450nm处吸光度值，计算各组细胞的半数抑制浓度(IC50)。

1.3.3RT-qPCR检测CircBIRC6、miR-126-5p表达:使用TRIzol试剂提取标本及各组细胞总RNA，然后对RNA进行逆转录合成cDNA，使用Taq qPCR Master Mix再进行RT-qPCR扩增，分别以β-actin、U6为内参，采用2-△△Ct法计算CircBIRC6、miR-126-5p相对表达。CircBIRC6上游引物(5′-3′)：TCAAGGAGACCAACTTTGGC；下游引物(5′-3′)：CTGGAGTTTGCAGAGCAGTG；β-actin上游引物(5′-3′)：CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC，下游引物(5′-3′)：GCGCCCAATACGACCAAATC；miR-126-5p上游引物(5′-3′)：GGTATAATCCGCCGCTTAGCTGCC，下游引物(5′-3′)：GTGCAGGGTTGCAAGGT；U6上游引物(5′-3′)：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物(5′-3′)：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.3.4细胞增殖实验:各组处理的A549/DDP细胞4×104个/孔接种于96孔板中，在37℃、5% CO2条件下培养48h后，使用CCK-8试剂盒检测各孔吸光度值(A)。

1.3.5细胞凋亡实验:离心收集转染的各组A549/DDP细胞，PBS洗涤后，使用binding buffer制备成1×106个/mL的细胞悬液，分别加入10μL的Annexin V-FITC与PI溶液，室温避光孵育20min，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3.6Western blot检测JARID2、Cyclin D1、P21、P-gp蛋白表达:使用RIPA液提取各组细胞总蛋白，经SDS-PAGE电泳后转膜，10%脱脂奶粉封闭2h，加入JARID2(1∶1000)、Cyclin D1(1∶1000)、P21(1∶1500)、P-gp(1∶1500)一抗稀释液，4℃孵育过夜，再加入HRP标记二抗(1∶2000)，室温孵育1h，ECL试剂显色，以β-actin为内参，分析各蛋白表达。

1.3.7CircBIRC6、JARID2与miR-126-5p的靶向关系:使用starbase在线预测CircBIRC6、JARID2与miR-126-5p的靶向关系，分别构建CircBIRC6、JARID2野生型与突变型表达载体，使用荧光素酶报告基因实验验证CircBIRC6、JARID2与miR-126-5p的靶向关系。

2 结 果

2.1CircBIRC6在敏感及耐药肺癌组织及A549、A549/DDP细胞中表达:与敏感肺癌组织相比，CircBIRC6在耐药肺癌组织中表达水平显著升高(P<0.05)，与A549细胞相比，A549/DDP细胞中CircBIRC6表达水平显著升高(P<0.05)，见图1。

图1 CircBIRC6在敏感及耐药肺癌组织及A549、A549/DDP细胞中表达

2.2DDP对A549、A549/DDP细胞的IC50值:DDP呈剂量依赖性抑制A549、A549/DDP细胞增殖，经计算，DDP对A549、A549/DDP细胞的IC50值分别为28.60μmoL/L、53.56μmoL/L，见图2。

2.3CircBIRC6与miR-126-5p靶向关系验证:通过starbase在线预测显示，CircBIRC6与miR-126-5p有结合位点，见图3。双荧光素酶报告基因检测结果显示，与CircBIRC6-WT+miR-NC组比较，CircBIRC6-WT+miR-126-5p mimics组荧光素酶活性显著降低(P<0.05)，见表1。而过表达CircBIRC6，miR-126-5p表达水平显著降低，抑制CircBIRC6表达，miR-126-5p表达水平显著升高，见表2，证明CircBIRC6与miR-126-5p存在靶向关系。

图2 MTT检测DDP对A549、A549/DDP细胞的IC50值

图3 CircBIRC6与miR-126-5p结合位点预测结合

表1 各组A549细胞双荧光素酶报告基因检测结果

2.4各组细胞CircBIRC6与miR-126-5p表达比较:与pcDNA组相比，pcBIRC6组CircBIRC6表达水平显著升高，miR-126-5p表达水平显著降低(P<0.05)；与si-NC组相比，si-BIRC6组CircBIRC6表达水平显著降低，miR-126-5p表达水平显著升高(P<0.05)；与si-BIRC6+inhibitor NC相比，si-BIRC6+miR-126-5p inhibitor组miR-126-5p表达水平显著降低(P<0.05)，CircBIRC6表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组细胞CircBIRC6与miR-126-5p表达比较

2.5各组细胞JARID2表达比较:与pcDNA组相比，pcBIRC6组JARID2表达水平显著升高(P<0.05)；与si-NC组相比，si-BIRC6组JARID2表达水平显著降低(P<0.05)；与si-BIRC6+inhibitor NC相比，si-BIRC6+miR-126-5p inhibitor组JARID2表达水平显著升高(P<0.05)，见表3与图4。

图4 各组细胞JARID2表达

表3 各组细胞JARID2表达比较

2.6CircBIRC6对A549/DDP细胞增殖、凋亡及IC50的影响:与pcDNA组相比，pcBIRC6组细胞增殖、Cyclin D1与P-gp蛋白表达及IC50值显著升高，细胞凋亡率及P21蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与si-NC组相比，si-BIRC6组细胞增殖、Cyclin D1与P-gp蛋白表达及IC50值显著降低，细胞凋亡率及P21蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与si-BIRC6+inhibitor NC相比，si-BIRC6+miR-126-5p inhibitor组细胞增殖、Cyclin D1与P-gp蛋白表达及IC50值显著升高，细胞凋亡率及P21蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，见表4、图5、图6。

表4 CircBIRC6对A549/DDP细胞增殖凋亡及IC50的影响

图5 各组细胞Cyclin D1、P21、P-gp蛋白表达

图6 各组细胞凋亡

2.7miR-126-5p与JARID2的靶向关系:通过starbase在线预测，发现JARID2-3’UTR上与miR-126-5p存在结合位点，见图7。进一步使用荧光素酶报告基因实验验证miR-126-5p与JARID2的靶向关系，与JARID2-WT+miR-NC相比，JARID2-WT+miR-126-5p mimics组细胞的荧光素酶活性降低(P<0.05)，而JARID2突变型细胞的荧光素酶活性无显著变化，见表5，表明JARID2是miR-126-5p的靶基因。而过表达CircBIRC6，miR-126-5p表达水平显著降低的同时，JARID2表达水平升高，抑制CircBIRC6表达，miR-126-5p表达水平升高的同时，JARID2表达水平降低，见表3，证明CircBIRC6可调控miR-126-5p/JARID2轴。

图7 miR-126-5p与JARID2靶向关系预测

表5 各组A549细胞双荧光素酶报告基因检测结果

3 讨 论

DDP为常见的化疗药物，用于多种恶性肿瘤的治疗，然而肿瘤对DDP的耐药性问题越来越突出，研究DDP的耐药性机制显得尤为重要[5]。有报道显示，circRNA可以调节DDP在NSCLC中的耐药性，CircBIRC6属于circRNA之一，在膀胱癌、肝癌中均上调表达，抑制CircBIRC6表达可抑制肿瘤细胞增殖、迁移及上皮间质转化[6]。本研究结果显示，CircBIRC6在耐药肺癌组织与细胞中表达水平显著升高，提示CircBIRC6可能与NSCLC耐药有关。已有报道显示，CircBIRC6在NSCLC组织与细胞中上调表达，通过抑制miR-217表达，上调β淀粉样蛋白前体蛋白结合蛋白2表达促进非小细胞肺癌的发展[7]。在卵巢癌中，抑制CircBIRC6表达可上调miR-367-3p表达，降低卵巢癌细胞对DDP的耐药性[8]。为探索CircBIRC6在A549/DDP细胞中的功能，本研究在A549/DDP细胞中干预CircBIRC6表达，结果显示，过表达CircBIRC6可增加A549/DDP细胞对DDP的耐药性，而抑制CircBIRC6表达增加A549/DDP细胞对DDP的敏感性，然而其具体作用机制尚不清楚。

circRNA可以作为miRNA海绵参与肿瘤耐药性，如上调circCUL2表达可通过抑制miR-888-5p表达，上调RB1CC1表达增强A549/DDP细胞对DDP的敏感性[9]。本研究显示上调或下调CircBIRC6表达，可抑制或下调miR-126-5p表达，研究表明，miR-126-5p在NSCLC中呈低表达，过表达miR-126-5p可抑制NSCLC细胞增殖和进展[10]；本研究通过生物信息学分析和荧光素酶报告基因检测结果显示，CircBIRC6与miR-126-5p存在靶向结合位点，抑制miR-126-5p表达可逆转抑制CircBIRC6表达对A549/DDP细胞增殖的抑制作用，提示CircBIRC6靶向调控miR-126-5p表达参与NSCLC化疗耐药性。Han等研究也证实，miR-126-5p与肺腺癌的放射敏感性有关，过表达miR-126-5p通过调控EZH2/KLF2/BIRC5轴，抑制细胞迁移并促进细胞凋亡，从而增强肺腺癌细胞对放射治疗的敏感性[11]。

JARID2是Jm-jC域(具有去甲基化活性)的SMCX蛋白，为Jumonji蛋白家族中的一员，在多种肿瘤中上调表达，通过促进肿瘤细胞的上皮间质转化，促进肿瘤侵袭与转移[12]。

在胶质瘤中，JARID2表达下调，过表达JARID2可抑制CCND1表达调节胶质瘤细胞生长和胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性[13]。本研究结果显示，在过表达CircBIRC6的A549/DDP细胞中，miR-126-5p表达水平降低，JARID2表达增加，而抑制CircBIRC6表达后，JARID2表达水平降低，并且在抑制CircBIRC6基础上同时下调miR-126-5p表达后，JARID2表达增加，表明miR-126-5p可靶向调节JARID2表达，且starbase在线预测与双荧光素酶报告基因检测结果证实miR-126-5p与JARID2有靶向结合位点，提示CircBIRC6可能通过miR-126-5p调控JARID2蛋白表达，参与NSCLC对DDP耐药性。Kuang等研究显示JARID2在DDP耐药的NSCLC细胞中上调表达，通过上调Notch1促进NSCLC干性和顺铂耐药[14]，也表明JARID2与肺癌顺铂耐药有关。

综上，CircBIRC6在A549/DDP细胞中高表达，CircBIRC6可通过靶向抑制miR-126-5p表达，上调JARID2表达，促进A549/DDP细胞对DDP的耐药性。