circ_0000615靶向调控miR-142-3p对骨肉瘤细胞增殖迁移侵袭的影响

李贺伟， 阮 锋

(华中科技大学同济医学院附属梨园医院， 湖北 武汉 430077)

骨肉瘤具有病情进展快、转移早、预后差、易复发等特点，靶向治疗是在特定导向机制作用下将药物选择性浓集定位于特定结构，可提高肿瘤局部治疗效果；靶向治疗骨肉瘤药物的研发及临床应用已经取得一定疗效，从基因角度入手找到精准的靶向治疗药物是目前分子靶向治疗研究的重点[1,2]。miRNA不仅影响骨肉瘤细胞的代谢，还参与骨肉瘤的发生、转移和复发，研究miRNA在骨肉瘤中的作用可为骨肉瘤的早期诊断和治疗提供新的研究方向[3]。研究发现miR-142-3p在骨肉瘤组织和细胞中表达均明显下调，过表达miR-142-3p通过调控靶基因HMGA1的表达抑制骨肉瘤细胞的生长、侵袭和迁移[4]。携带miR-142-3p的外泌体可通过抑制COX-2的表达来抑制骨肉瘤细胞的生长。Circular RNA Interactome在线软件预测显示circ_0000615和miR-142-3p有互补序列。circ_0000615是来源转录因子ZNF609的一种circRNA，位于chr15:64791491-64792365；研究报道circ-ZNF609高表达促进肾癌细胞增殖和侵袭能力[5]。乳腺癌患者血浆中has_circ_0000615高表达，与肿瘤分期、淋巴结转移密切相关。circ_0000615在鼻咽癌组织和细胞中高表达，敲低circ_0000615抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化(EMT)[6]。然而circ_0000615对骨肉瘤细胞恶性生物学行为的影响尚不清楚。本实验旨在研究circ_0000615可否通过调控miR-142-3p影响骨肉瘤细胞的恶性生物学行为。

1 材料与方法

1.1材 料

1.1.1临床材料：选取2017年1月至2021年1月本院收治的60例骨肉瘤患者的骨肉瘤组织及瘤旁组织患者手术前未进行过放化疗，所有患者均经病理学诊断确诊为骨肉瘤，排除标准：合并其他恶性肿瘤；全身系统性疾病者。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者及其家属知情且签署知情同意书。

1.1.2细胞与主要试剂：骨肉瘤细胞U2OS(美国ATCC)；Trizol试剂、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒(日本Takara公司)；蛋白提取试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒、四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT)比色法试剂盒(北京Solarbio公司)；Transwell小室、基质胶(美国BD公司)；荧光素酶报告基因载体(美国Promega公司)。

1.1.3主要仪器：3550型酶标仪(美国Thermo Fisher)，AB7500 Real-Time PCR仪(美国Applied Biosystems)。

1.2方 法

1.2.1细胞处理与分组：于RPMI-1640培养基中常规培养骨肉瘤细胞U2OS，将circ_0000615干扰表达载体及阴性对照、miR-142-3p模拟物及阴性对照miR-NC转染至U2OS细胞，记为si-circ_0000615组、si-NC组、miR-142-3p组、miR-NC组；将circ_0000615干扰表达载体分别与miR-142-3p抑制剂及阴性对照转染至U2OS细胞，记为si-circ_0000615+anti-miR-142-3p组、si-circ_0000615+anti-miR-NC组。

1.2.2RT-qPCR检测circ_0000615和miR-142-3p表达：骨肉瘤组织、瘤旁组织、转染的骨肉瘤细胞U2OS的总RNA采用Trizol试剂提取，根据试剂盒进行反转录、随后配置PCR反应体系，检测circ_0000615和miR-142-3p表达。PCR反应条件如下：95℃预变性5min，95℃变性15s，59℃退火15s，共40个循环。根据2-△△Ct法计算相对表达量。circ_0000615引物序列：F 5’-TTGGGAACTAAACCGGAGCC-3’，R 5’-GGACAACATCATTGCTTTTCAGAC-3’；GAPDH引物序列：F 5’-TATCGTGATGCTAGTCCGATG-3’，R 5’-TGCAGCTAGCTGCATCGATCGG-3’；miR-142-3p引物序列：F 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGG-3’，R 5’-CGACGTGTAGTGTTTCCTA-3’；U6引物序列：F 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，R 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.3MTT测定细胞增殖抑制率：各组细胞培养48h，按试剂盒说明操作，测定490nm处吸光度(OD)值。计算细胞增殖抑制率(%)。

1.2.4克隆形成实验检测细胞克隆数：将各组U2OS细胞接种于6孔板，调整细胞密度后取出相应体积，统计每孔细胞数，每孔100个，培养2周，将甲醇、吉姆萨分别进行固定与染色，细胞克隆数(>50个细胞)在光学显微镜下统计。

1.2.5Transwell法检测细胞迁移和侵袭数：迁移：U2OS用无血清培养液饥饿24h，调整细胞浓度为5×105/mL，Transwell上室加入100μL上述细胞悬液，培养24h，分别以甲醇、0.1%结晶紫进行固定、染色，于显微镜下记数。侵袭：基质胶包被Transwell上室，其余同迁移实验操作。

1.2.6蛋白质印迹(Western blot)法：借助蛋白提取试剂盒获得U2OS细胞总蛋白，进行SDS-PAGE、转聚偏二氟乙烯膜，聚偏二氟乙烯膜封闭1h后，加入E-cadherin(美国Abcam)、N-cadherin(美国Abcam)和GAPDH抗体(美国Abcam)后4℃孵育12h，室温加入二抗，孵育2h后化学发光液显影，分析E-cadherin、N-cadherin蛋白条带相对于GAPDH的灰度值。

1.2.7双荧光素酶报告实验：分别将circ_0000615野生型/突变型(WT/MUT)荧光素酶载体与miR-142-3p模拟物或阴性对照miR-NC共转染U2OS细胞，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒操作指南，测量荧光素酶活性。

2 结 果

2.1circ_0000615和miR-142-3p在骨肉瘤中的表达：骨肉瘤组织中circ_0000615表达水平高于瘤旁组织(2.06±0.33比1.00±0.18，t=21.843)，miR-142-3p表达水平低于瘤旁组织(0.44±0.10比1.06±0.13，t=27.865)，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 骨肉瘤中circ_0000615和miR-142-3p表达

2.2沉默circ_0000615对U2OS增殖迁移侵袭的影响：与si-NC组相比，si-circ_0000615组circ_0000615表达水平降低，U2OS细胞抑制率升高，U2OS细胞克隆数、迁移侵袭数降低，E-cadherin表达升高，N-cadherin表达下降(P<0.05)，见图2。

图2 沉默circ_0000615对U2OS增殖迁移侵袭的检测

2.3circ_0000615靶向调控miR-142-3p：Circular RNA Interactome在线软件预测显示circ_0000615和miR-142-3p有互补序列，见图3A。miR-142-3p与circ_0000615野生型报告质粒共转染后细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)，见图3B；与si-NC组相比，si-circ_0000615组miR-142-3p表达水平升高(P<0.05)，见图3C。

图3 circ_0000615靶向调控miR-142-3p

2.4miR-142-3p抑制U2OS增殖迁移侵袭：与miR-NC组相比，miR-142-3p组U2OS细胞中miR-142-3p表达水平升高，细胞抑制率上升，U2OS细胞克隆数、迁移和侵袭数减少，E-cadherin表达水平升高，N-cadherin表达水平降低(P<0.05)，见图4。

2.5抑制miR-142-3p和circ_0000615诱导U2OS增殖迁移侵袭：与si-circ_0000615+anti-miR-NC组相比，si-circ_0000615+anti-miR-142-3p组U2OS细胞中miR-142-3p表达、U2OS细胞抑制率、E-cadherin表达降低，U2OS细胞克隆数、迁移侵袭数增加，N-cadherin表达升高(P<0.05)，见图5。

图4 miR-142-3p对U2OS增殖迁移侵袭的检测

图5 抑制miR-142-3p和circ_0000615对U2OS增殖迁移侵袭的检测

3 讨 论

骨肉瘤是一种高度侵袭性的癌症。最近，非编码RNA在骨肉瘤中的失调引起了科学界的极大兴趣。既往研究表明，circRNAs在多种癌症中的作用，包括胃癌、结直肠癌等[7,8]。circ_0000615(circ-ZNF609)是近几年新发现的一种circRNA，研究报道circ-ZNF609能促进不同肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，例如宫颈癌[9]、胃癌[10]、胶质瘤[11]。然而，circ_0000615在骨肉瘤中的表达和作用尚不清楚。本实验结果显示，骨肉瘤组织中circ_0000615高表达，提示circ_0000615可能与骨肉瘤发生发展有关。本研究还发现，沉默circ_0000615后，U2OS细胞增殖和迁移侵袭能力下降，E-cadherin表达升高，N-cadherin表达降低，提示沉默circ_0000615可抑制U2OS细胞增殖、迁移和侵袭，与circ_0000615在鼻咽癌、宫颈癌、胃癌、胶质瘤中的功能相吻合。

为深入研究circ_0000615在骨肉瘤中的作用机制，本研究通过在线软件预测到miR-142-3p可能是circ_0000615的靶基因。研究报道miR-142-3p在骨肉瘤细胞中表达下调，对骨肉瘤细胞生长和进展有抑制作用[12]。本实验结果显示，miR-142-3p在骨肉瘤组织中低表达，且过表达miR-142-3p后，U2OS细胞增殖、迁移侵袭能力下降，N-cadherin表达降低，与前人报告吻合。本实验还发现circ_0000615靶向调控miR-142-3p；抑制miR-142-3p可减轻circ_0000615对U2OS细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，提示沉默circ_0000615对骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用的分子机制与靶向下调miR-142-3p表达相关。

综上所述，沉默circ_0000615可通过靶向调控miR-142-3p抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。但关于其下游靶基因尚需下一步探究。