时差成像系统对IVF/ICSI周期胚胎发育及移植结局的影响

乔静，冯玲，颜秋霞，周秀琴，朱振杰，张国志，陈彩蓉

(广州医科大学附属第六医院，清远市人民医院生殖医学中心，清远 511520)

胚胎选择是体外受精过程中进行胚胎移植的关键因素，相当一部分患者的胚胎移植入子宫后并不能着床[1]。近年来国际会议上对单胚胎移植的呼声越来越高，故而胚胎优选环节相当重要。体外受精中最常用的胚胎选择方法是胚胎的形态分级[2]。然而，这种方法需要在特定的时间点将胚胎移出培养箱在显微镜下观察胚胎，胚胎学家可获得的信息相对有限；而且将胚胎移入和移出培养箱存在安全隐患及培养环境改变影响培养体系的稳定，从而影响胚胎发育。

随着IVF中时差成像(Time-lapse imaging，TLI)技术的引入，通过在确定的间隔和焦平面捕捉图像来连续监测胚胎发育成为可能[3]。TLI的优点之一是能够在不干扰培养条件的情况下实时观察胚胎[4]，并提供了一种无创的方法来识别具有最高植入潜能的胚胎。自从这项技术投入使用以来，可以通过TLI识别与相关形态动力学参数预测胚胎发育和临床结局。然而，关于其在临床上的应用意义并未达成普遍共识。

本研究通过比较本中心TLI培养与常规培养的胚胎发育情况和妊娠结局，探讨TLI的临床应用价值，以期为TLI技术挑选胚胎移植提供参考。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2019年1月至2020年12月在我中心行体外受精(IVF)或卵胞浆内单精子注射(ICSI)并选择新鲜周期移植的510例患者的510个周期的临床资料。其中使用TLI系统培养胚胎的166个周期为TLI组，使用常规培养胚胎的344个周期为常规组。

纳入标准：女方年龄<40岁，因输卵管堵塞和卵巢高反应或男方因素(重度少、弱、畸精子症，梗阻性无精子症，性功能障碍等)接受辅助生殖治疗；促排卵方案主要为改良长方案或拮抗剂方案；IVF/ICSI周期；首次行辅助生殖技术助孕，新鲜周期卵裂胚移植。

排除标准：获卵数≤3个；合并子宫内膜息肉、子宫肌瘤、输卵管积水、子宫畸形(如纵隔子宫)、宫腔粘连、子宫内膜异位症、巧克力囊肿、复发性流产等；夫妻双方染色体异常，或患有遗传性疾病；合并自身代谢性疾病，如糖尿病、高血压、甲状腺相关疾病等；基础资料收集不全；男方无精子症、睾丸发育不良、泌尿生殖系统炎症。

二、诊疗回顾

1.取卵及人工授精：患者进行改良长方案或拮抗剂方案促排卵。当女方有2个或2个以上卵泡直径≥18～20 mm时，肌肉注射HCG(珠海丽珠制药)，34～36 h后经阴道超声引导下穿刺取卵，记录获卵数。男方在女方取卵日当天取精，精子和卵子在体外结合16～18 h后脱颗粒，或直接将卵子脱颗粒后行ICSI。所有患者在选择胚胎培养方式(常规培养、TLI系统培养)时，均在医生告知情况后自愿做出决定，并签署胚胎培养知情同意书。

2.胚胎培养：受精后的2PN胚胎转入含G-1培养液(Vitrolife，瑞典)的培养皿。常规组放入普通培养箱(Labotech C60，德国)，培养环境为6.0%CO2、5%O2、37℃；TLI组放入Embryoslid培养皿，置于Embryo Scope时差培养箱(Vitrolife，瑞典)，培养箱环境6.0%CO2、5%O2、37℃。胚胎培养至第3天时，挑选优质胚胎进行新鲜移植或者冷冻，剩余胚胎换液继续培养至第5或第6天，常规组胚胎更换至含G-2培养液(Vitrolife，瑞典)的培养皿；TLI组暂停拍照，取出培养皿，将G-1培养液吸出，尽快换成G-2培养液，再次放入TLI系统中培养。设置拍照时间间隔为1次/10 min和每小时7个等距的焦平面扫描，连续拍摄3～6 d。

3.胚胎评分和移植：常规组根据传统胚胎评分方法(根据卵裂球分裂数目、卵裂球大小、均一度及碎片率)对胚胎进行评级，本中心的优质胚胎定义为第3天卵裂球数目7～9个、卵裂球均一且碎片率≤20%。而TLI组则根据标记胚胎发育的各个关键时间点结合胚胎发育动力学以及胚胎形态学优选胚胎。每组根据各患者的具体情况，选择1～2枚优质卵裂期胚胎进行新鲜周期移植。TLI组移植前需回看胚胎发育过程选择优质胚胎，排除直接卵裂、逆卵裂、多核等异常发育来源的胚胎；剩余胚胎继续囊胚培养。囊胚评分采用Gardner评分系统，根据囊胚的扩张和孵出程度将其分为1～6期，对3～6期的囊胚进一步评价内细胞团(ICM)和滋养层细胞(TE)质量。本中心定义3BC及以上的囊胚为可利用囊胚，≥3BB者为优质囊胚。

4.临床结局评价：移植后14 d测β-HCG，阳性者于4～6周B超检查见孕囊者为临床妊娠。

三、观察分析指标

患者一般资料，包括年龄、体质量指数(BMI)、基础激素水平、不孕相关资料等；促排卵资料，包括Gn用量、获卵数等；受精及胚胎培养资料，包括受精结局和胚胎质量评估；新鲜周期移植结局，包括移植胚胎数量及质量、移植日内膜厚度、胚胎种植率、临床妊娠率、流产率、双胎率等。临床妊娠率和种植率以胚胎移植后第5周超声检查探及宫内孕囊为标准。

四、统计学分析

结 果

一、两组患者的一般资料及促排卵情况比较

本研究共纳入510例患者的510个周期，其中常规组344个周期、TLI组166个周期。两组患者的女方BMI、不孕年限、基础FSH水平、原发性不孕占比、Gn总量、获卵数比较均无显著性差异(P>0.05)，而TLI组的女方年龄显著小于常规组，获卵数显著高于常规组(P<0.05)(表1)。

表1 两组患者的一般资料及促排卵情况比较[(-±s)，n(%)]

二、两组患者间胚胎发育情况比较

TLI组的正常受精率显著高于常规组(P<0.001)，且囊胚形成率、可利用囊胚率与优质囊胚率均显著高于常规组(P<0.05)；其它的相关评价指标比较均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 两组间胚胎发育情况比较(%)

三、两组患者间新鲜周期移植结局比较

TLI组平均移植胚胎数显著少于常规组(P<0.05)；TLI组胚胎种植率、临床妊娠率及流产率均略高于常规组，双胎率略低于常规组，但均无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表3 两组间新鲜移植周期临床结局比较[(-±s)，%]

四、基于倾向性得分评分匹配后的结果

考虑到基线数据包括年龄、获卵数两组不均衡，本研究进一步对数据进行倾向性得分评分匹配，比例为1∶1，最终得到常规组和TLI组各164例。

两组患者间基线资料比较均无显著性差异(P>0.05)(表4-1)。相关结局与未匹配前基本一致，TLI组正常受精率、囊胚形成率、可利用囊胚率、优质囊胚率均显著优于常规组(P<0.05)(表4-2)；TLI组移植胚胎数显著低于常规组(P<0.05)，而组间胚胎种植率、临床妊娠率、流产率、双胎率均无显著性差异(P>0.05)(表4-3)。

表4-1 倾向性匹配后两组间基础资料比较[(-±s)，%]

表4-2 倾向性匹配后两组间胚胎发育情况比较(%)

表4-3 倾向性匹配后两组间新鲜移植周期临床结局比较[(-±s)，%]

讨 论

TLI作为新的胚胎培养及观察系统，根据其提供的完整胚胎动力学参数，可观察到胚胎发育的异常事件，为胚胎学家挑选胚胎提供有利的依据。因此，TLI系统也越来越广泛地应用于各大生殖中心实验室，用于卵裂期胚胎的培养与选择。

本研究发现，通过TLI系统培养的胚胎其正常受精率要比常规培养组高。伊斯坦布尔共识认为精卵结合后原核将在(17±1)h时间段出现[5]，但少部分胚胎可能会发生原核早消失或者晚发生事件[6]。而我中心常规培养的胚胎一般在受精18～19 h左右拿出培养箱在显微镜下观察，因此有时会错过原核观察的时间；而TLI系统可以实时监控原核的发生及消失，并以每10 min拍摄1次的频率和每小时7个等距的焦平面扫描，减少了漏检的几率，因此，TLI系统培养较常规培养有更高的正常受精率。

胚胎正常的卵裂过程可能与正常的细胞骨架功能、诱发卵母细胞受精的激活事件(如钙离子振荡)、线粒体功能以及高质量染色体有关[7-8]。这几个因素可以在卵裂异常的发生中起作用，延迟和异常的分裂模式可能表明DNA损伤或染色体分离错误，这些错误可以激活一些细胞周期检查点，阻止细胞周期进程，甚至导致非整倍体发生。有研究发现，通过TLI系统观察到异常卵裂的胚胎行囊胚培养后，其囊胚形成率及优质囊胚率均低于正常卵裂的胚胎[4，7-9]；通过TLI的计算机自动细胞追踪软件结合形态学评估，可显著提高囊胚期的胚胎发育能力[从(18.3±23.3)%提高到(68.2±1.7)%，P<0.05][2，10]。但2020年高洋等[11]研究表明，使用TLI系统培养的D3胚胎的可利用胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚率及优质囊胚率与常规培养相比较并无显著性差异(P>0.05)。本研究发现，与常规组相比较，TLI组卵母细胞利用率及D3优质胚胎率并没有提高，但囊胚形成率、可利用囊胚率和优质囊胚率均显著改善(P<0.05)；且考虑到年龄、获卵数在两组间的不均衡，进一步通过倾向性得分评分匹配后，仍得到相同的结论。分析认为在常规培养中，一些被评为1、2级的优质胚胎，使用TLI系统有可能观察到这些胚胎发生了卵裂扭转、细胞直接卵裂、逆向卵裂及多核现象等，从而把它们归为非优质胚胎，这有可能是本研究中TLI组D3优质胚胎率与常规组相比没有提高的原因，而这些发育异常的胚胎有可能培养成很好的囊胚；此外TLI系统无干扰的培养环境保证获取图像信息的同时不造成培养环境波动[12]，有助于胚胎的发育，这可能也是本次研究中TLI组的囊胚形成率、可用囊胚率和优质囊胚率比常规组高的原因。

有研究认为，发生多核的胚胎可能是由于染色体畸变或发生嵌合造成的，而多核发生在4细胞期或同时发生在2细胞与4细胞时期，可能会降低患者的临床妊娠率和着床率[3，13]。Ergin等[3]表明，胚胎发生异常第一次胞质分裂、异常分裂和无序卵裂等现象，其胚胎后期发育潜能明显低于正常分裂的胚胎。一项使用不同方法的荟萃分析表明，与传统的孵育和评估相比，通过TLI优选胚胎，避免了异常卵裂胚胎被移植，妊娠结局有所改善，显著增高了持续妊娠率，降低了早期妊娠损失[4]。2019年的一篇综述对9项随机对照试验、2 955名妇女进行总结，认为没有足够的证据表明TLI结合胚胎选择软件优选胚胎，比传统孵育和评估优选胚胎在活产率、流产率或临床妊娠率方面存在显著差异[14]。Meseguer等[15]在一项对1 882个周期的回顾性研究中比较了TLI系统和常规胚胎培养的累积活产率，该研究显示两者的累积活产率相似[15]。因此，TLI系统在改善临床结局这一方面依旧存在争议。然而在本次研究中我们发现，新鲜胚胎移植周期中，TLI组在平均胚胎移植个数显著少于常规组的情况下，临床妊娠率有增长的趋势(57.22% vs. 51.16%；倾向性匹配后57.32% vs. 54.88%)，双胎率有降低趋势(21.05% vs. 24.43%；倾向性匹配后21.28% vs. 25.56%)，虽然尚无统计差异(P>0.05)，但这在某种程度上说明正是因为使用TLI系统让胚胎在稳定的环境中培养，避免胚胎暴露在非生理条件下，如pH和温度变化或气体(CO2和O2)浓度改变，减少了胚胎产生物理和化学应激反应的风险[16]；且TLI系统让我们连续地观察到胚胎发育的全过程，从而可以更好、更精准地选择胚胎移植，在减少移植胚胎个数的基础上并未影响临床结局，减低了双胚移植带来的多胎妊娠风险，为临床实行单胚胎移植提供了很好的参考依据。

综上所述，TLI系统作为新型胚胎培养体系，比常规培养更加便捷与稳定，并且提高了正常受精率、可利用囊胚率及优质囊胚率，更有利于挑选优质胚胎进行临床移植；虽现有数据显示TLI系统对临床结局的改善并不显著，但随着TLI系统的普及，可通过多中心前瞻性大数据研究进一步论证其对临床结局的影响。