IVF-ET周期中2、4细胞卵裂球多核细胞发育情况及胚胎移植后妊娠结局观察

陈磊，蒋如煜，王珊珊

南京大学医学院附属鼓楼医院，南京 210008

单胚胎移植(SET)是降低多胎妊娠危险性的重要手段之一。如何挑选最具发育潜力的胚胎，提高体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的成功率是目前胚胎学家的研究重点。根据ESHRE共识[1]，分裂期胚胎评估的主要参数有第3天胚胎卵裂球数目及大小均一性、碎片、空泡等。最新研究[2]报道，受精第2天胚胎卵裂球单核可能是独立反应优质胚胎的新标志。人类胚胎发育早期时卵裂球多核是一种常见现象。但第一次有丝分裂与第二次有丝分裂后出现的卵裂球多核通常被认为是一种胚胎异常情况，50%以上的卵裂球多核胚胎是非整倍体、嵌合型及更加复杂的混合型，可降低IVF-ET周期中的囊胚形成率、种植率[3]。目前临床评估胚胎形态学常采用倒置显微镜，卵裂球核状态的评估受限。时差成像技术(TLI)可使胚胎学家获取更多胚胎发育相关的细节性参数。TLI检测的具有卵裂球多核的胚胎中，高达72.3%多核胚胎的在ESHRE/ALPHA共识规定时间范围内不能被识别[4]。目前，国内针对胚胎卵裂球多核现象的研究大部分集中于4细胞阶段，2细胞卵裂球多核是否影响胚胎发育的相关研究较少。因此，我们采用TLI动态观察了卵裂早期卵裂球多核情况，评价其囊胚期胚胎质量，探讨2、4细胞卵裂球多核对胚胎发育及母体妊娠结局的影响。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年3月～2017年10月间在南京鼓楼医院殖医学中心行IVF-ET的患者96例，纳入标准：①年龄< 35岁；②基础FSH<10 IU/L；③获卵数5～15枚；④女方不孕原因均为盆腔输卵管因素；⑤周期数< 2个。排除标准:①存在部分或完全受精失败周期史；②男性因素不育；③1～3C或2～5C出现异常分裂的胚胎者。患者均行IVF治疗。纳入者一般资料比较具有可比性，均签署知情同意书。

1.2 体外受精及胚胎培养 采用常规促排方案[6]，B超监测卵泡生成发育，待优势卵泡直径18 mm以上，行阴道B超引导下卵泡穿刺获卵。将获得的卵冠丘复合体充分洗涤后放入IVF培养皿孵育3 h，与精子按1∶100 000的比例共孵育5 h，机械法剥除颗粒细胞，镜下观察到卵细胞第二极体释放，判断受精成功，受精成功后将卵细胞转移至含G1培养液的Slide皿中，置于Embryo Scope培养系统中培养到第3天。

1.3 卵裂早期卵裂球多核情况观察 于受精(17±1)h时采用TLI系统镜观察胚胎卵裂早期卵裂球多核情况。本研究采用TLI系统是Embryo Scope(Vitrolife ，瑞典)[5]，整套系统包括三个部分：培养系统、分析软件及耗材，拍照频率10 min/次，可记录胚胎发育过程中原核变化情况、卵裂方式与时间，专用培养皿为12孔皿。根据镜下早期卵裂球核特征将其分为无多核胚胎(A组)、2细胞卵裂球多核者(2细胞一个卵裂球多核及4细胞无多核、2细胞均有多核及4细胞无多核胚胎，B组)、4细胞卵裂球多核者(2细胞一个卵裂球多核及4细胞至少一个卵裂球多核、2细胞均有多核及4细胞期至少一个卵裂球多核胚胎，C组)、2细胞无多核且4细胞至少一个卵裂球多核胚胎者(D组)。

1.4 囊胚期胚胎质量评价 培养第3天评价各组胚胎质量，计算各组培养第3天优质胚胎率，培养第3天优质胚胎标准：8个≤细胞数≤10个,卵裂球大小均匀，碎片<10%。 培养第5、6天根据ALPHA/ESHRE指南评价囊胚期胚胎质量[7]，根据囊胚腔扩张程度将囊胚分为1～6级，同时根据内细胞团大小与滋养层细胞数划分A～C级，本研究将囊腔扩张在4级以上，且内细胞团与滋养层不同时为C级的胚胎归为可利用囊胚。培养第5、6天测算各组可利用囊胚率。

1.5 胚胎移植及妊娠结局观察 在一个移植周期中，优先挑选无卵裂球多核胚胎进行移植。本研究中，如果患者一个周期中存在无卵裂球多核的胚胎且分裂方式正常，则优选这个胚胎进行移植，如果在一个周期中，仅有几个分裂方式正常但都存在早期卵裂球多核，则优先移植2细胞多核，4细胞无多核，且卵裂球多核数量越少越好，移植胚胎选择顺序为A、B、C、D组。本研究移植的均为第3天分裂期胚胎。移植14 天时抽取患者空腹外周血，检测血HCG>5 IU/L为生化妊娠，移植4～6周时B超下见孕囊及胎心为临床妊娠。临床妊娠者随访观察妊娠结局。计算妊娠率、流产率及活产率。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行处理。组间均数比较采用t检验，组间率的比较采用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

共通过 TLI进行培养96个周期，最终纳入613个胚胎。613个胚胎根据卵裂早期卵裂球多核情况分为A组276个、B组160个(其中2细胞一个卵裂球多核及4细胞无多核胚胎73个、2细胞均有多核及4细胞无多核87个)、C组140个及D组37个。培养第3天，A、B、C及D组优质胚胎率分别为54.35%(150/276)、34.38%(55/160)、21.43%(30/140)及24.32%(9/37)，与其他各组比较，培养第3天，A组优质胚胎率最高(P均<0.05)；与B组比较，C组优质胚胎率降低(P均<0.05)。培养至第5天，A、B、C及D组可利用囊胚率分别为50.91%(84/165)、34.65%(44/127)、20.63%(23/128)、13.51%(5/37)，培养至第6天，A、B、C及D组可利用囊胚率分别为35.76%(59/165)、18.11%(23/127)、8.60%(11/128)、0(0/37)，培养至第5、6天，与其他各组比较，A组可利用囊胚率最高(P均<0.05)；与B组比较，培养第5、6天C组可利用囊胚率降低(P均<0.05)。

最终A组进行72个周期胚胎移植，A组年龄(31.4±4.29)岁，BMI(22.46±3.11)kg/m2,基础FSH(7.47±2.06)IU/L,基础LH(4.84±2.14)IU/L,内膜厚度(10.72±2.39)mm，获卵数(11.36±2.55)个，移植成功率58.33%(42/72)，流产率7.14%(3/42)，活产率54.17%(39/72)。B组共进行8个周期胚胎移植，其中2细胞一个卵裂球多核及4细胞无多核胚胎4个，移植者年龄(32.50±3.20)岁，BMI(20.76±1.71)kg/m2,基础FSH(7.11±1.29)IU/L,基础LH(6.77±2.12)IU/L,内膜厚度(9.00±1.22)mm，获卵数(12.37±2.48)个，3例患者种植成功，0例流产，3例均为活产；2细胞均有多核及4细胞无多核胚胎4个，移植者年龄(29.5±2.87)岁，BMI(21.90±1.89)kg/m2,基础FSH(7.32±0.57)IU/L,基础LH(9.73±5.08)IU/L,内膜厚度(12.38±1.98)mm，获卵数(10.62±1.98)个，4例患者种植成功，1例流产，3例活产。

3 讨论

人类胚胎发育早期卵裂球多核是一种常见现象，约43.2%的胚胎在2细胞阶段具有卵裂球多核现象[8]。因此胚胎卵裂早期卵裂球多核胚胎的发展潜力是目前的研究热点[9]。研究发现，多核化与非整倍体和染色体异常率的增加之间存在相关性[10]。部分早期卵裂球多核的胚胎在发育的过程中能够进行自我修复，减少多核带来的不良影响，且多核胚胎有一半能发育到囊胚阶段，超过20%的胚胎发育成形态学良好的囊胚[11]。而本研究结果显示，B、C、D 组胚胎共培养292枚，其中第五天与第六天可利用囊胚共形成106枚，卵裂球多核胚胎囊胚可利用率达到36.30%，说明早期卵裂率球多核的胚胎具有一定的发育潜能，根据鼠胚染色体分离动力学研究[12]发现，早期胚胎分裂时纺锤体长度的变化可能在染色体分离中起着至关重要的作用，即在第1次有丝分裂时纺锤体长度明显较第2次有丝分裂时短，染色体十分接近卵裂球中央位置，因此，胚胎完成第1次有丝分裂至2细胞阶段时卵裂球多核现象的发生率明显较高。本研究结果中，胚胎发育至2细胞阶段多核率为48.93%，在胚胎继续发育过程中4细胞阶段卵裂球多核现象减少达到53.33%，同时相对于2细胞阶段多核，4细胞阶段多核胚胎在降低培养第3天优质胚胎率和培养第5天囊胚可利用率方面，差异具有统计学意义，表明大多数胚胎在早期卵裂分裂期间具有更强的自我校正能力，且4细胞期卵裂球多核对胚胎发育的影响更广[11]。

本研究结果同时显示在2细胞阶段，仅含单个卵裂球多核的胚胎的培养第3天优质胚胎率和可利用囊胚率均高于双卵裂球多核的胚胎，而Alikani等[14]发现在培养第2天胚胎中，未观察到多核的卵裂期胚胎的囊胚形成率要高于含有1至2个卵裂球出现多核的胚胎，两者阶段不一样，但都说明了随着多核的增加，胚胎的囊胚形成率降低。

最新研究[15]还提示随着胚胎内单核卵裂球的数目增多，胚胎的着床能力也会增加。除此之外，Hashimoto等[13]发现，如果胚胎第一次有丝分裂正常，其2细胞期出现的多核对胚胎的种植并不会产生影响，他们认为2细胞期多核并不应该成为胚胎移植刷选的排除因素，而4细胞期多核被认为是胚胎移植的排除标准。本研究最终仅统计到8例多核胚胎移植者，其中4例2细胞期单个卵裂球多核，发育至4细胞期无多核的胚胎移植后3例临床妊娠，另有4例2细胞期卵裂球均多核，发育至4细胞期均无多核的胚胎移植后，4例临床妊娠，其中1例流产。表明早期卵裂球多核的胚胎能够产生妊娠，但是由于本次研究例数较少，无法进行统计学分析，在以后的研究中将一步扩大样本数据进行分析。

综上所述，2、4细胞卵裂球多核均可影响胚胎发育，且存在4细胞卵裂球多核的胚胎质量更低，早期卵裂球多核胚胎也可以用于胚胎移植。早期卵裂球多核是胚胎发育过程中常见的现象，且随着多核卵裂球数量增加，对胚胎发育的影响越大。TLI技术能够详细观察到卵裂球多核现象，将早期卵裂球多核与胚胎形态学参数相结合，可用来临床挑选最优胚胎移植，来提高单胎活产率。