不同发育阶段、不同质量囊胚冷冻复苏移植周期妊娠结局分析

李澎涛，殷晨星，王 娜，邢 鹏，孟娜娜，郭战坤

(河北省保定市妇幼保健院生殖医学科，河北 保定 071000)

随着囊胚培养及玻璃化冷冻技术的出现及发展，明显提高了患者冻融胚胎移植周期妊娠率及胚胎着床率[1]，因此囊胚冻融移植在很多生殖中心得到广泛应用。那么如何在冻融周期选择更具有发育潜能的囊胚进行移植是一个目前有待解决的问题。依据Gardner囊胚分级法[2]囊胚扩张程度及孵出程度分期为1～6期，依据内细胞团(inner cell mass,ICM)、滋养层(trophoderm,TM)细胞数多少及紧密程度分级为A、B、C三级。大多生殖中心对3期以上，ICM或TM评级不同时为C的囊胚进行冷冻或移植，而就选择哪一时期，什么质量的囊胚移植能够获得更好的妊娠结局目前具有争议。有的研究认为孵出囊胚缺乏透明带的保护，在移植过程中容易造成滋养层连接断裂致使囊胚腔液外流，导致妊娠率、着床率的降低[3]，也有研究认为孵出囊胚更易着床[4]。高质量囊胚能够获得更高的妊娠率、着床率[5-7]，然而就ICM及TM哪一个对胚胎的着床更重要，亦没有定论。本研究回顾分析了2015年1月—2019年10月在保定市妇幼保健院生殖医学科接受单囊胚FET周期的患者资料，比较相同质量不同发育阶段、相同发育阶段不同质量囊胚FET周期妊娠结局差异，探讨囊胚的发育阶段、囊胚质量对单囊胚FET周期的着床率、临床妊娠率、活产率等指标的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2015年1月—2019年10月在保定市妇幼保健院生殖医学科接受单囊胚FET周期的患者资料。纳入标准：①单囊胚FET周期；②女方年龄20～35岁；③女方体重指数(body imass index,BMI)18～25；④双方均无遗传性疾病；⑤采用自然周期或人工周期内膜准备方案。排除标准：①子宫畸形患者；②子宫内膜异位症患者。

1.2囊胚选择及冻融移植 依据Gardner囊胚分级法[2]对囊胚进行评价，选择3期以上且滋养层或内细胞团评级不同时为C的囊胚冷冻保存。

优质囊胚：根据Gardner评分标准，3期及3期以上且内细胞团和滋养层评分不含C的囊胚；非优质囊胚：3期及3期以上内细胞团和滋养层中含有一个C级评分的囊胚。

囊胚的冷冻及解冻试剂为日本Kitazato公司的冷冻/解冻套装，冷冻载体为日本加藤冷冻载杆Cryotop。冷冻前对囊胚进行激光打孔皱缩，在37 ℃、6%CO2培养箱放置5～10 min，待囊胚进一步皱缩后，按照冷冻/解冻套装说明书操作步骤对囊胚进行冷冻及解冻。复苏后对3/4期囊胚进行激光辅助孵化，在37 ℃、6%CO2培养箱培养2～3 h，观察囊胚扩张情况，部分或完全扩张为存活胚胎。

使用PICC移植管一段式装管后超声引导下将复苏囊胚移植至子宫腔中后部。移植后35 d腹部超声下见孕囊及胎心为临床妊娠。

1.3内膜准备 采用人工周期、自然周期进行内膜准备。人工周期,在周期第2～4天开始口服17β雌二醇或戊酸雌二醇4 mg，至第7天开始阴道超声监测子宫内膜发育。当子宫内膜厚度≥8 mm，且雌激素最少应用14 d，开始加用孕酮，第1天和第2天黄体酮针20 mg、地屈孕酮20 mg，第3天起一直应用黄体酮40 mg、黄体酮胶囊400 mg、地屈孕酮20 mg。如内膜准备好后开始进行内膜转化，应用孕激素内膜转化后第6天解冻移植囊胚期胚胎移植。自然周期,在自然周期第8～10天开始超声监测卵泡发育。卵泡直径<10 mm，隔2日超声监测一次，卵泡直径10～14 mm时，隔日监测一次，优势卵泡直径>14 mm，每日监测一次，并同时检测血LH、E2、P及尿LH。连续血激素、尿LH检测提示LH峰出现后24～36 h为排卵时间，超声监测至排卵，于排卵后4 d解冻囊胚期胚胎移植。

1.4研究分组 由于3期囊胚移植周期数据少，本研究仅对4～6期囊胚进行了分组研究。依据囊胚扩张/孵出状态及质量将囊胚分为A1组(4期优质囊胚组)、A2(4期非优质囊胚组)、B1组(5期优质囊胚组)、B2组(5期非优质囊胚组)、C1组(6期优质囊胚)、C2组(6期非优质囊胚)。

1.5观察指标及判定标准 临床妊娠率=超声下能检测到孕囊的妊娠周期数/移植周期数×100%；着床率=超声下检测到的孕囊数/移植胚胎数×100%；流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%；异位妊娠率=异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%，活产率=活产周期数/移植周期数×100%。

1.6统计学方法 应用SPSS 20.0软件分析数据。计量资料比较采用单因素方差分析，若不符合正态分布，则采用非参数检验进行比较。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同发育阶段优质囊胚FET周期妊娠结局比较 依据囊胚扩张状态不同，比较4～6期各阶段优质囊胚324个FET周期妊娠结局的情况，其中A1组148周期、B1组66周期、C1组110周期。各组间患者年龄、不孕年限、BMI、既往周期数、FET内膜准备方案和移植日子宫内膜厚度差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。临床结局，优质胚胎组，A1组FET周期的妊娠率、着床率显著高于B1组(P<0.05)，A1与C1组FET周期的妊娠率、着床率差异无统计学意义，但C1组的妊娠率、着床率有下降趋势； A1、B1、C1 3组FET周期流产率、活产率、男/女比例、孕周及新生儿体重差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1 优质囊胚FET周期各组患者基本情况比较Table 1 Comparison of basic condition of patients in each group with high quality blastocysts during FET cycle of

表2 优质囊胚FET周期患者妊娠结局情况比较Table 2 Comparison of pregnancy outcome in patients with high quality blastocysts during FET cycle

2.2不同发育阶段非优质囊胚FET周期妊娠结局比较 依据囊胚扩张状态不同，比较4～6期各阶段非优质囊胚组255个FET周期妊娠结局的情况，其中A2组141周期、B2组52周期、C2组62周期。各组间患者年龄、不孕年限、BMI、既往周期数、FET内膜准备方案和移植日子宫内膜厚度差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。临床结局，A2、B2、C2三组FET周期妊娠率、着床率，流产率、活产率、男/女比例、孕周及新生儿体重差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表3 非优质囊胚FET周期各组患者基本情况比较Table 3 Comparison of basic conditions of patients with non-high-quality blastocysts in each group during FET cycle

表4 非优质囊胚FET周期患者妊娠结局情况比较Table 4 Comparison of pregnancy outcome in patients with non-high-quality blastocyst during FET cycle

2.3相同发育阶段不同质量囊胚FET周期妊娠结局比较 依据囊胚内细胞团及滋养层质量的不同，比较4～6期相同发育阶段优质囊胚与非优质囊胚临床结局的差异。患者基本情况，各组间患者年龄、不孕年限、BMI、既往周期数、FET内膜准备方案和移植日子宫内膜厚度差异无统计学意义(P>0.05)，见表5。临床结局，A1组FET的临床妊娠率、着床率、活产率高于A2组，差异有统计学意义(P<0.05)，而流产率、孕周数及新生儿体重差异无统计学意义(P>0.05)。B1组与B2组、C1组与C2组FET的临床妊娠率、着床率、流产率、活产率、男/女比例、孕周数、新生儿出生体重差异均无统计学意义(P>0.05)，见表6。

表5 相同发育阶段不同质量囊胚FET周期患者基本情况比较Table 5 Comparison of basic conditions of patients with blastocysts of different quality and at the same developmental stage during FET cycle

表6 相同发育阶段不同质量囊胚FET周期患者妊娠结局情况比较Table 6 Comparison of pregnancy outcomes of patients with blastocysts of different quality and at the same developmental stage during FET cycles

3 讨 论

目前囊胚的冷冻大多数中心采用玻璃化冷冻，但胚胎的冷冻过程会造成透明带的硬化，导致囊胚的孵化障碍，影响胚胎的着床。辅助孵化技术的应用使冻融周期移植前的70%囊胚处于正在孵出或已经孵出状态[4]，能够显著改善冻融胚胎移植后的妊娠率及着床率[8]，尤其对于质量差、发育速度慢的囊胚，辅助孵化能够显著提高胚胎移植后的着床率[9]。薛林涛等[10]利用Time-lapse系统观察比较辅助孵化和未辅助孵化冻融囊胚发现进行了辅助孵化的囊胚的囊胚孵出率、完全孵出率及 U 型孵出率均显著高于未辅助孵化的囊胚，同时后者8字型孵出率显著升高。目前用于冷冻的囊胚多为3～6期，至于哪个阶段冻融后能够获得更好的妊娠结局，仍存在一定的争议。笔者回顾分析了2015—2019年间在我院接受FET治疗579周期患者资料，通过比较相同质量不同发育阶段囊胚FET周期妊娠结局差异及相同发育阶段不同质量囊胚FET周期妊娠结局的差异，分别探讨囊胚的发育阶段及质量对囊胚FET周期妊娠结局的影响。

Zhao等[9]通过将IVF-ET及FET周期单囊胚移植妊娠患者与未妊娠患者对比发现，妊娠组的囊胚扩张程度显著高于未妊娠组囊胚扩张程度，因此研究认为囊胚的扩张程度是预测单囊胚移植妊娠结局的一项重要指标尤其在FET周期。秦祖兴等[11]比较新鲜单囊胚移植周期4～6期囊胚组与3期囊胚组的妊娠结局差异，发现前者的临床妊娠率及着床率显著高于后者，这与Marren等[12]的结果一致，此研究认为扩张期囊胚的临床结局显著优于早期囊胚，同样Du等[13]的研究亦证实相较于3囊胚，4/5期囊胚具有更强的着床潜能。但郭娜等[14]通过分析2 593例新鲜周期及复苏周期的单囊胚移植妊娠结局的分析，发现3～6期各阶段囊胚的临床妊娠率、着床率、早期流产率及活产率各项参数之间差异无统计学意义(P>0.05)，这与朱序理等[15]的的结果相近，此研究通过回顾分析囊胚的扩张程度、滋养层及内细胞团质量对冻融周期妊娠结局的影响，建立优选单囊胚顺序的方案发现囊胚扩张程度与临床妊娠率没有相关性。在本研究中非优质囊胚组不同扩张程度囊胚间的妊娠结局各项指标均无显著性差异，但优质囊胚组4期囊胚的妊娠率、着床率显著高于其余各组囊胚的妊娠率、着床率，分析原因可能是由于孵出囊胚缺乏透明带保护导致囊胚在冻融过程中易受到损伤，因此建议囊胚培养过程中增加囊胚的观察次数，减少孵出囊胚的冷冻。

那么囊胚的发育阶段是否为预测囊胚发育潜能独立因素呢？在Zhao等[9]的研究中FET周期妊娠组囊胚扩张程度高于未妊娠组，而囊胚的滋养层及内细胞团等级2组间差异无统计学意义，此研究认为囊胚的扩张程度是预测临床妊娠结局的一项重要参数，而且囊胚的扩张程度在一定程度上反映了细胞数的多少，扩张程度越大细胞数也越多，因此在FET周期胚胎选择时应优先考虑囊胚的扩张状态。但在张建瑞等[16]的最新研究中无论是在新鲜移植周期还是复苏移植周期，优质囊胚的妊娠率、着床率均显著高于非优质囊胚的妊娠率及着床率，而囊胚的质量对妊娠后不良产科及围产期结局没有影响。有研究[17]表明非优质囊胚的非整倍体率显著高于优质囊胚，孙庆云等[18]认为囊胚的非整倍体率与囊胚的发育天数及扩张程度显著相关，而与内细胞团及滋养层的评级无显著相关性，但亦有报道[19]不同质量外滋养层囊胚的整倍体率间无显著差异，而囊胚的分期和内细胞团评级是囊胚整倍体率影响因素。Stephenson等[20]对285对复发性流产夫妇的420份标本进行核型分析发现流产率与胚胎的非整倍体率密切相关。Subira等[21]的报道显示C级内细胞团囊胚移植活产率比A级内细胞团囊胚移植活产率下降了55%，而且C级囊胚内细胞团囊胚移植的流产率显著高于A/B级内细胞团囊胚移植的流产率，而滋养层的质量对妊娠结局没有影响。但亦有报道[22-24]认为滋养层在胚胎着床的过程中更重要，Chen等[22]分析了263个单囊胚移植复苏周期的数据，发现A/B级滋养层囊胚的妊娠率、着床率及活产率显著高于C级滋养层囊胚的妊娠率、着床率及活产率，而不同质量内细胞团的囊胚间并无这些差异。本研究中就相同发育阶段优质囊胚与非优质囊胚移植的妊娠结局进行比较，以排除囊胚的扩张及孵出状态对结局造成的影响，结果显示4期优质单囊胚移植的妊娠率、着床率显著高于4期非优质单囊胚移植的妊娠率、着床率、活产率，但两者在流产率、孕周及新生儿体重等参数间差异无统计学意义，5、6期优质与非优质囊胚间的妊娠率、着床率、流产率、活产率、孕周及新生儿体重等参数间差异无统计学意义，这与倪晓蓓等[25]的研究结果相似。由于目前的囊胚评级主要依据囊胚的形态学特征进行判断，具有很强的主观性，造成在滋养层及内细胞团评级上可能存在一定的差异，对妊娠结局的影响也有所不同。

综上所述，囊胚的发育阶段及滋养层/内细胞团质量均都对复苏周期单囊胚移植的妊娠结局有一定的影响，本研究中4期优质囊胚复苏周期妊娠率、着床率显著高于其余各组，因此在复苏胚胎选择时应予以优先考虑，从而提高移植效率，使患者利益最大化。但由于本研究数据量偏少，因此结论存在一定的局限性，有待更多数据的研究。