盐酸氯丙嗪急性中毒致死小鼠血浆中差异代谢物的筛选

刘鑫鑫，白 锐，刘文乔，谢 冰，文 迪，马春玲*

(1.河北医科大学法医学院2017级，河北 石家庄 050017；2.河北医科大学法医学院，河北省法医学重点实验室，河北省法医分子鉴定协同创新中心，河北 石家庄 050017；3.河北科技大学化学与制药工程学院，河北 石家庄 050018)

盐酸氯丙嗪，又名冬眠灵，为第一代典型抗精神病药物[1]，属于中枢多巴胺受体的拮抗剂[2]，具有抗精神病、降温、镇静、镇吐、催眠等多种药理活性[3]，可广泛抑制中枢系统[4]，小剂量用于精神性障碍疾病治疗[5]，但大剂量可致嗜睡、视力模糊、意识障碍、呼吸抑制、直立性低血压、持续性低血压休克甚至心搏骤停[6-8]。用药不规范或者服毒自杀等情况导致过量盐酸氯丙嗪中毒时有发生[9]，但目前盐酸氯丙嗪中毒的鉴定尚缺乏科学的判断标准。非靶向代谢组学是一种研究生物样品中所有内源性代谢物的方法[10],能最大程度反映生物体总的代谢物信息，对生物体内小分子代谢物进行定性、定量分析，发现潜在的生物标志物[11-14]。本研究采用非靶向代谢组学方法，通过多元统计分析方法筛选出盐酸氯丙嗪中毒小鼠血浆内差异代谢物，进而为盐酸氯丙嗪中毒致死案件的鉴定提供方法及法医学理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 选取SPF级 ICR小鼠24只，鼠龄7～8周，雌雄各半，体重(38±5)g，由辽宁沈阳长生公司提供，动物许可证号：SCXK(辽)2015-0001，动物饲料、水、光照、环境湿度、环境温度均有严格要求。

1.1.2仪器与材料 UltiMateTM3000高效液相色谱仪串联Q ExactiveTMFocus质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，Acquity HSS T3 色谱柱(2.1 mm×100 mm 1.8 μm；美国 Waters 公司)，高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)，旋涡振荡器(美国CORNING公司)，KQ-500DE型数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)，Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)，盐酸氯丙嗪(大连美伦生物科技有限公司)，色谱纯甲醇(北京迪马欧泰科技发展中心)，色谱纯乙腈(北京迪马欧泰科技发展中心)。

1.2方法

1.2.1动物模型 24只ICR小鼠适应性培养7 d，随机分为盐水对照组、盐酸氯丙嗪实验组，每组12只。实验前一晚禁食，不禁水，灌胃前少量给食。实验组给予盐酸氯丙嗪120 mg/100 g灌胃；对照组给予等量生理盐水灌胃，并于灌胃后1 h行颈椎脱臼处死。

1.2.2检材处理 立即吸取死后小鼠腹主动脉血0.8～1.0 mL后放入肝素处理过的1.5 mL离心管内，4 ℃下以离心半径8.5 cm，5 000 r/min离心5 min，取上清；然后再次离心，4 ℃下以离心半径8.5 cm，12 000 r/min离心10 min，取上清100 μL与甲醇-乙腈混合液(甲醇∶乙腈=1∶1，V/V)按1∶3体积混合后震荡，超声10 min。于-20 ℃冰箱内静置15 min，取上清，供UPLC-HRMS检测。

1.2.3组织病理学检查 取死后小鼠肝和肾组织浸入10%中性福尔马林48 h后，经脱水、浸蜡、切片后常规苏木素-伊红染色，光学显微镜下观察两组模型器官病理改变。

1.2.4UPLC-HRMS检测色谱条件：本实验采用Acquity HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm 1.8 μm；美国 Waters 公司)；柱温40 ℃；流速 300 μL/min；流动相组成:A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸，洗脱梯度：0～1 min，2% B；1～3 min，2%～15%B；3～6 min，15%～50%B；6～9 min，50%～95%B；9～12 min，95%B；12.00～12.01 min，95%～2%B；12.01～15 min，2%B。进样量:5 μL，进样室温度4 ℃。

质谱条件：采用HESI离子化方式；喷雾电压：正极，3.0 kV；负极，2.7 kV。毛细管温度320 ℃，加热器温度300 ℃；鞘气流速：30 arb，辅助气流速：15 arb;扫描模式为Full Scan/dd-MS2，采集范围为70～1 500 m/z，正负离子切换采集模式；分辨率采用MS Full Scan 35 000 FWHM，MS2 17 500 FWHM，NCE为12.5 eV, 25 eV和37.5 eV。

1.3差异代谢物的筛选与鉴定 将原始数据导入 Compound Discovery 3.0(美国Thermo Fisher Scientific公司)进行数据统计前预处理。处理后的数据上传至MetaboAnalyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca/)网站进行PCA及OPLS-DA分析，筛查出VIP>1的差异代谢物，并结合t检验(P<0.05)及差异倍数(fold change≥2或≤0.5)，进一步筛选出有统计学意义的差异代谢物。再将筛选结果通过与HMDB(https://hmdb.ca/)及mzCloud数据库进行一级精确分子量及二级质谱碎片比对后进行核查，确定差异代谢物。

2 结 果

2.1组织病理学检查 与对照组相比氯丙嗪急性中毒致死组肝组织可见肝细胞胞浆淡染及空泡变性，肝窦、肝板结构消失；肾组织肾小管腔内可见粉染淀粉样细颗粒物，肾小球未见明显异常(图1)。

2.2代谢组学分析 通过PCA及OPLS-DA化学计量学模型对Compound Discovery 3.0预处理后数据进行分析。图2A显示24个样本2 200多个代谢物经PCA建模后两组样本区分明显。OPLS-DA模型(图2B)显示对照组与氯丙嗪急性中毒致死组样本可明显区分，100次置换检验(Q2=0.959，R2Y=0.991)显示模型预测能力良好，且未出现过拟合现象(R2Y横坐标值<1，图2C)。

图1 盐酸氯丙嗪急性中毒致死小鼠肝、肾组织病理学变化(右上角为局部放大，HE染色 ×400)

2.3差异代谢物的筛选与鉴定 采用OPLS-DA 模型筛选出VIP>1的代谢物，再经t检验及差异倍数检验(fold change)(P<0.05,FC≥2或FC≤0.5)筛选出300多个差异代谢物，筛选代谢物结果以火山图可视化呈现见图3，FC(Fold Change)是各个样本间表达量的比值，即差异倍数，横坐标为以2为底、差异倍数的对数，纵坐标表示以10为底、t检验P值的对数，图中紫色点为显著性差异代谢物，黑色点为非显著性差异代谢物。

图3 盐酸氯丙嗪急性中毒致死小鼠血浆差异代谢物火山图

对筛选出的差异性代谢物进行在线数据库匹配，鉴定出的差异代谢物及其参与的代谢通路汇总结果见表1。最终确定29个可能有生物学意义的差异代谢物，其中苯并噻嗪2个(外源性)，脂肪酰基9个，羧酸及其衍生物5个，咪唑并嘧啶3个，嘌呤核苷酸、吲哚及其衍生物、有机氮化合物各2个，酮酸及其衍生物、非金属氧阴离子化合物、有机氧化合物、呋喃各1个。并对两组差异性代谢物进行可视化聚类分析(图4)。

表1 盐酸氯丙嗪急性中毒致死小鼠血浆差异代谢物列表Table 1 List of differential metabolites in plasma of mice due to lethal acute poisoning with chlorpromazine hydrochloride

图4盐酸氯丙嗪急性中毒致死小鼠血浆差异代谢物热力图

3 讨 论

医源性药物中毒死因判定一直是法医工作者面临的一个难题，而药物与死亡发生之间的关联性是中毒死亡判定中的难点。随着代谢组学的发展，使获取药物中毒甚至致死后特征性内源性标志物成为可能。超高压液相色谱-高分辨质谱联用仪器在解决样本成分分离基础上大大提高了样品成分相对分子质量检测的准确度，是法医毒物定性定量检测的金方法，也是科研工作中强大的数据挖掘工具[15]。本研究通过分析小鼠盐酸氯丙嗪中毒致死模型代谢物特点以筛选中毒死亡小鼠血浆差异代谢物，从而为人涉药致死案例的证明及排除提供依据。

本研究检测并鉴定出的29个差异代谢物中，除了氯丙嗪及产物丙嗪外，其他27个差异代谢物均为内源性代谢产物，涉及到的种类主要为脂肪酰基，羧酸及其衍生物，咪唑并嘧啶等。首先，在脂肪酰基类差异代谢物中，L-乙酰肉碱在脂肪酸氧化中可促进乙酰辅酶A进入哺乳动物线粒体基质，同时还具有神经保护作用[16]。通过3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶产生甲羟戊酸是胆固醇生物合成的限速酶[17]。因此，中毒致死组小鼠血浆L-乙酰肉碱含量降低，甲羟戊酸含量升高以及其他几种脂肪酰类物质含量异常提示肝脏脂肪酸及胆固醇代谢异常，且流行病学研究也发现氯丙嗪是当时所有抗精神病药物中最容易引起肝脏急性损伤的药物[18]。羧酸及其衍生物差异代谢物中，非对称性二甲基精氨酸是存在于血浆并参与蛋白修复过程的副产物，非对称性二甲基精氨酸会干扰L-精氨酸产生一氧化氮，一氧化氮是内皮和心血管健康的关键化学物质，且与神经、心血管疾病相关[19]。同时，足够高含量的甲基丙二酸可扮演酸原和生物毒素的角色，前者引起的酸中毒会直接产生心脏毒性以及一系列精神症状如：震颤、嗜睡和癫痫发作。其次，对所有这些代谢差异物中，非对称性二甲基精氨酸、亚精胺是已定义的尿毒症毒素，同时，血浆中磷酸盐升高是肾透析患者的普遍症状，且与死亡风险的增加相关，而且肾脏功能的失代偿所引起的K+、Ca2+异常会影响心脏电生理活动，甚至心源性猝死。最后，α-酮戊二酸、非对称性二甲基精氨酸、5-甲氧基吲哚乙酸酯差异代谢物的升高与乙酰胆碱及胺类(多巴胺、γ-氨基丁酸、5-羟色胺)神经递质代谢有关，结合单磷酸腺苷、磷酸、次黄嘌呤及鸟嘌呤参与的嘌呤代谢异常，从多方面体现了氯丙嗪作用于中枢系统后对机体神经体液调节的广泛而又重要的干预效应。上述所筛选的代谢产物可为氯丙嗪中毒致死案例的鉴别提供理论和实践依据。

本研究运用基于UPLC-HRMS技术的代谢组学方法，并应用 OPLS-DA分析结合t检验及差异倍数筛选出血浆中与盐酸氯丙嗪中毒致死密切相关的29种潜在的差异代谢物，为今后法医学盐酸氯丙嗪中毒死因判定提供了研究基础。