取卵与ICSI注射时间间隔对ICSI周期临床结局的影响

宏苹苹，李涛，欧建平

(中山大学附属第三医院生殖医学中心，广州 510630)

卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)是一种用于治疗不孕特别是严重男性因素所致不孕的辅助生殖技术，其过程是利用显微操作技术将单个精子注射到卵母细胞的细胞浆中，使其受精，培养成胚胎，再植入女方宫腔内，从而达到妊娠目的。卵母细胞质量是受精和胚胎发育的重要因素之一[1-2]。卵母细胞在受精前暴露于体内和体外环境的时间对于获得高质量的卵母细胞和胚胎可能具有至关重要的意义。Rienzi等[3]研究了卵母细胞不同预孵育期与ICSI结果之间的关系，发现ICSI前至少3 h的预孵育期可以提高胚胎质量。其他研究表明，在ICSI前进行卵母细胞预孵育与卵母细胞成熟、受精和胚胎质量的提高有关[4-5]。但也有研究认为，在颗粒细胞剥离之前延长卵母细胞孵育时间对受精或ICSI结局没有影响[6-9]。

有研究结果显示，注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)后36 h取卵，可以促进卵母细胞成熟，从而改善胚胎和妊娠结局，是影响ICSI妊娠率最为重要的因素[10-11]。如果HCG作用时间不够，即使推迟剥离颗粒细胞及注射精子，也无法弥补卵母细胞在卵泡微环境中暴露时间不足的缺陷。迄今为止，取卵后到ICSI注射的最适时间仍有争议。黄国宁等[12]指出ICSI注射应安排在取卵后2～4 h进行，而Dozortsev等[13]的研究得出ICSI注射的最佳时间是HCG后37～41 h的结论。Kilani等[14]发现，多数MⅡ期卵母细胞在HCG后39～40.5 h可以观察到纺锤体且有最高的阻滞值，因此HCG后39～40.5 h可能是ICSI的最佳时间。

基于辅助生殖胚胎实验室的日常工作安排，本中心的ICSI注射一般为取卵后4 h以上，特殊情况可提前至取卵后2～4 h，但临床上关于不同的取卵与ICSI注射时间间隔(OPU-ICSI时间间隔)是否会影响ICSI周期结局还有争议。因此，本研究旨在探讨本中心不同OPU-ICSI时间间隔行ICSI的周期结局，以期更好地优化周期管理和工作流程。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2015年9月至2020年5月在中山大学附属第三医院生殖医学中心因男性因素不孕而接受ICSI周期治疗患者的临床资料。排除标准：(1)无精子症患者及冷冻精液周期；(2)未获卵周期；(3)无可利用胚胎周期；(4)未移植周期。

本研究共纳入1 205例患者的1 205个新鲜移植或冻融胚胎移植(FET)周期。根据OPU-ICSI时间间隔不同，将患者分为A组(间隔2～4 h，362例)和B组(间隔>4 h，843例)。

二、研究方法

1.促排卵方案：主要采用黄体期长方案或拮抗剂方案。以超声检查、血尿黄体生成素(LH)峰值测定等方法综合监测卵泡的生长发育。并根据卵巢反应调整促性腺激素(Gn)的剂量，当超声下观察到双侧卵巢至少有1个卵泡直径达18 mm时，肌肉注射HCG 6 000～10 000 U，36 h后在阴道超声引导下取卵。

2.体外授精：获得的卵母细胞冲洗干净后，置于含10%人血清白蛋白(HSA)的G-IVF(Vitrolife，瑞典)培养液中，覆盖矿物油(Vitrolife，瑞典)，放置于37℃、6%CO2、5%O2和89%N2环境的三气培养箱(COOK，美国)中培养，直至去除颗粒细胞。根据实验室工作安排，在取卵后一定时间将卵母细胞置于透明质酸酶(SAGE，丹麦)中消化去除颗粒细胞后进行ICSI注射。注射后将卵母细胞洗净，置于含5%HSA的G-1(Vitrolife，瑞典)培养液中培养。精液处理采用密度梯度离心法。

3.胚胎培养：ICSI注射后16～18 h观察受精情况，评估胚胎的正常受精率(2PN受精率)、异常受精率和ICSI退化率(ICSI卵母细胞退化指卵母细胞在ICSI注射后或者第2天观察受精时发生凋亡；ICSI退化率=ICSI退化卵母细胞数/注射MⅡ卵总数×100%)。将正常受精的胚胎置于含5%HSA的G-1微滴中培养至第3天，根据胚胎卵裂球数目、卵裂球均一性及碎片程度对胚胎质量进行评估。经患者知情同意后选择移植或冷冻或者在含5%HSA的G-2(Vitrolife，瑞典)培养液中继续培养至囊胚。囊胚质量评估采用Gardner评分法[15]。

4.胚胎冷冻和解冻：胚胎冷冻使用开放式玻璃化冷冻系统(Kitazato，日本)；解冻使用玻璃化解冻试剂盒(Kitazato，日本)，解冻后胚胎放置于含5%HSA的G-2培养液中培养2 h后再移植。

5.胚胎移植和妊娠判断：本研究纳入患者的首次移植资料，即取卵周期的首次新鲜移植或者取卵周期全胚冷冻后的首次FET。选择评分最高的1～2枚卵裂期胚胎或囊胚在超声引导下进行胚胎移植。临床妊娠定义为胚胎移植后6～7周经超声检查出现至少1个孕囊(包括异位妊娠)及胎心搏动。

三、统计学分析

结 果

一、患者基本情况

本研究共纳入1 205例患者，其中A组362例，B组843例。两组患者的平均年龄、体质量指数(BMI)、Gn用量、扳机日E2水平、注射HCG与取卵时间间隔(HCG-OPU时间间隔)及不同卵巢刺激方案占比均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者的基本资料比较[(-±s)，n(%)]

二、两组患者的实验室指标和临床结局比较

两组患者的各项实验室指标如获卵数、卵子成熟率、受精率、2PN受精率、异常受精率、ICSI退化率、优胚率、移植胚胎类型、平均移植胚胎数等差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。两组间的临床妊娠率、流产率、活产率、新生儿平均出生孕周及出生体重均无统计学差异(P>0.05)(表3)。

表2 两组患者的实验室指标比较[(-±s)，M(P25，P75)，n(%)]

表3 两组患者的临床结局比较[(-±s)， n(%)]

三、Pearson相关性分析结果

OPU-ICSI时间间隔与主要实验室指标的相关性分析显示，OPU-ICSI时间间隔与卵子成熟率(P=0.099)、2PN受精率(P=0.497)和优胚率(P=0.910)均无显著相关性(表4)。

四、二元Logistic回归分析结果

将可能影响临床妊娠率的各种因素，包括女方年龄、扳机日E2水平及OPU-ICSI时间间隔等纳入Logistic回归分析，调整混杂因素后发现，在1 205例患者中，女方年龄、获卵总数、2PN受精率、优胚率能显著影响临床妊娠率(P<0.05)，而OPU-ICSI时间间隔、HCG-OPU时间间隔等因素并不显著影响临床妊娠率(P>0.05)(表5)。

表5 临床妊娠率影响因素的二元Logistic回归分析

讨 论

获得高质量的成熟卵母细胞是辅助生殖治疗中的关键因素之一。在卵泡生长的最后阶段存在一个复杂的动态过程，包括结构、分子和生化修饰，称为卵母细胞成熟。在此过程中，卵母细胞周围颗粒细胞的连接蛋白和缝隙连接的表达与卵母细胞在短时间内成熟有关[16-18]。HCG-OPU时间间隔是卵母细胞体内成熟的关键[19]。研究证实，适当延长体内成熟时间，即HCG-OPU时间间隔>36 h，有助于促进卵母细胞的成熟，从而改善胚胎质量和妊娠结局[10-11]。在本研究中，按照OPU-ICSI时间间隔不同分为间隔2～4 h组(A组)和>4 h组(B组)，两组的HCG-OPU时间间隔均>36 h，B组的卵子成熟率略高于A组，但两组间差异无统计学意义(P>0.05)。

有研究表明，在ICSI周期中，卵母细胞取出到ICSI注射之间的预孵育期可提高卵母细胞成熟率、受精率和胚胎质量[3-5，13，20]。因为卵母细胞在ICSI注射前的孵育可诱导胞浆成熟，使卵母细胞获得充分激活，从而提高受精率和妊娠率。在本研究中，B组的卵子成熟率和受精率略大于A组，2PN受精率和优胚率略低于A组，但差异均无统计学意义(P>0.05)。Pearson相关性分析结果也表明，OPU-ICSI时间间隔与卵子成熟率、2PN受精率及优胚率无显著性相关(P>0.05)。还有研究表明，受精率提高的原因不仅与细胞质的进一步成熟有关，还与卵母细胞的老化有关[9，21]。第二次减数分裂有两个重要的调节因子：M期启动子(MPF)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，二者随着卵母细胞的老化活性降低，从而导致卵母细胞的自发激活[22-23]。因此，MPF水平较低的老化卵母细胞更有可能被ICSI激活形成原核，从而解释了受精率随着OPU-ICSI时间间隔延长而增加的原因，但老化的卵母细胞中，异常受精也可能增加[24]。另外，一些研究发现，颗粒细胞剥除前孵育2～4 h可以提高优质胚胎率[5，25]；但孵育时间越长，优质胚胎率就越低[23]。潜在的原因可能是因为颗粒细胞能促进卵母细胞胞质的进一步成熟，有利于随后的胚胎发育[26-27]。

Pujol等[9]的一项回顾性试验提出，OPU-ICSI时间间隔每增加1 h，临床妊娠率下降7.7%。也有研究发现，卵母细胞在ICSI注射前孵育4或6 h的妊娠率相似或增加，但超过6 h后妊娠率显著下降[22，28]。这可能是由于卵母细胞在剥除颗粒细胞前孵育一段时间达到了受精的最佳状态，但过度孵育会导致超微结构和基因表达的改变，增加纺锤体异常的发生率，从而影响胚胎的发育潜能[29-30]。但也有研究表明，OPU-ICSI时间间隔不影响ICSI的受精和妊娠结局[6-9]。Garor等[6]的研究发现，延迟卵母细胞剥离或ICSI注射并没有增加受精或妊娠率，本研究结果与之相似。本研究中两组间的临床妊娠率、流产率、活产率及新生儿出生结局均无显著性差异(P>0.05)，并且对影响临床妊娠率的因素进行了回归分析，校正混杂因素后发现女方年龄、获卵总数、2PN受精率和优胚率能显著影响临床妊娠率(P<0.05)，而OPU-ICSI时间间隔等与临床妊娠率没有显著关联(P>0.05)。如今ICSI的最佳注射时间仍无定论，本中心在参考国内外共识、相关论著及自身工作安排等基础上，将ICSI注射时间定为取卵后大于4 h，特殊情况如法定节假日等为了不延长工作时间可调整在取卵后2～4 h行ICSI注射。本研究的结果显示，不同的OPU-ICSI时间间隔并不会对患者的妊娠结局造成明显的负面影响，这有助于胚胎实验室工作人员有效地安排工作，提高实验室工作效率。

综上，OPU-ICSI时间间隔与临床妊娠率没有显著关联，在不影响ICSI周期妊娠结局的情况下，灵活地安排ICSI时间，可以优化周期管理和工作流程，以适应辅助生殖治疗日益增长的需求。