褪黑素抑制玉米赤霉烯酮诱导的猪卵巢颗粒细胞凋亡

周佳伟，吴俊静，乔 木，王孝忠，刘贵生，梅书棋，彭先文

（1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，武汉 430064；2.湖北省宜昌市动物疫病预防控制中心，湖北 宜昌 443000）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA）是由镰刀菌属产生的一种真菌毒素，具有类雌激素作用，能够与雌激素受体α 和雌激素受体β 结合，导致雌激素水平失调，影响动物生殖［1］。卵泡内包括卵母细胞、颗粒细胞和壁细胞，雌激素主要由颗粒细胞产生，雌激素/孕酮的比例直接影响卵泡的发育，当雌激素/孕酮比例过低会导致颗粒细胞的凋亡，引发卵泡闭锁［2］。研究表明，ZEA 会促进卵巢颗粒细胞的凋亡、阻碍卵母细胞的成熟并提高细胞内的活性氧的水平［3-5］。

褪黑素（Melatonin，MT）主要是由哺乳动物下丘脑松果体产生的一种吲哚胺类激素，已被报道与卵泡发育过程密切相关［6］。Liu 等［7］进一步研究发现褪黑素不仅提高猪卵巢颗粒细胞中雌激素的含量，且可以调控与细胞增殖及凋亡等相关基因的表达水平。Wang 等［8］发现褪黑素通过褪黑素受体上调BCL2、BCL-XL、GPX4 和SOD1 的表达和下调BAX、CASP3 和TP53 的表达来抑制卵巢颗粒细胞的凋亡。在氧化应激条件下，褪黑素通过PI3K/AKT 信号通路抑制FOXO1 蛋白的转录活性以及介导SIRT信号通路提高FOXO1 蛋白的去乙酰化，从而提高小鼠卵巢颗粒细胞的抗氧化能力并抑制细胞自噬［9］。

本研究从3～5 mm 的卵泡中抽取卵泡液，分离猪卵巢颗粒细胞，通过添加不同浓度的ZEA 探究其对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响，并进一步通过加入不同浓度的褪黑素来检测褪黑素能否抑制ZEA 对猪卵巢颗粒细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞分离及培养

从武汉市某生猪屠宰场采集猪卵巢组织，用37 ℃含1% 双抗（链霉素和青霉素）的PBS 溶液清洗3 次，用1 mL 注射器扎破直径3～5 mm 的卵泡，抽取卵泡液，静置2 min；将收集好的卵泡液依次使用100 μm 和70 μm 的细胞筛过滤，将过滤后的卵泡液1 000 r/min 离心5 min，弃上清；加入含1% 双抗无血清DMEM/F12 培养基洗涤，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，重复3 次；加入含1% 双抗和10%FBS 的DMEM/F12 细胞培养基，放置在37 ℃下5%CO2细胞培养箱中培养；分离24 h 后更换新鲜细胞培养基，48 h 后便可将猪卵巢颗粒细胞接种，用于后续试验。

1.2 猪卵巢颗粒细胞凋亡检测

分离猪卵巢颗粒细胞，接种到6 孔板中，当细胞密度达2×106个/mL 时，分别使用0、3、10、30、50 和100 μmol/L 的ZEA 处理细胞，24 h 后每孔加入400 μL 不含EDTA 的胰酶消化细胞，用含10% FBS 的DMEM/F12 培养基终止消化并收集细胞；用PBS 溶液洗涤细胞2 次，2 000 r/min 离心5 min，收集细胞；加入500 μL 的Binding Buffer 悬浮细胞；加入5 μL Annexin V-FITC 混匀后，再加入5 μL Propidium Iodidie，混匀；室温、避光、静置15 min；上机检测。

1.3 猪卵巢颗粒细胞的活力检测

分离猪卵巢颗粒细胞，将其接种到96 孔板中，当细胞密度达2×106个/mL 时，分别使用0、0.1、1、10 和100 μmol/L MT 的无血清培养基培养细胞，24 h 换液，PBS 溶液洗涤2 次后更换30 μmol/L 的ZEA 处理猪卵巢颗粒细胞，ZEA 处理后24 h，每孔加入10 μL CCK8 试剂，并将细胞继续放置到培养箱中培养4 h；使用酶标仪检测样品在450 nm 波长下的吸光度。

2 结果与分析

2.1 ZEA 显著促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡

采集母猪卵巢，从3～5 mm 的卵泡中抽取卵泡液，分离猪卵巢颗粒细胞，当细胞密度达2×106个/mL时，分别使用0、3、10、30、50 和100 μmol/L 的ZEA处理细胞，24 h 后收集细胞，通过流式细胞术检测凋亡细胞的比例（图1）。3 和10 μmol/L 的ZEA 对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响不显著，而30、50 和100 μmol/L 均显著促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡，且随着ZEA 浓度的增加，凋亡细胞比例逐渐提高。ZEA 可显著促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡，且呈现剂量效应关系。

图1 ZEA 促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡

2.2 褪黑素抑制ZEA 诱导的猪卵巢颗粒细胞凋亡

细胞内活性氧的积累是ZEA 导致细胞凋亡的关键因素，而MT 作为一种广谱抗氧化剂，能够有效减少由氧化应激引发的细胞凋亡。本研究中检测MT 能否抑制ZEA 引发的猪卵巢颗粒细胞的凋亡，将MT 加入到DMEM/F12 培养基中，稀释成含有0、0.01、0.1、1、10 和100 μmol/L MT 的无血清培养基，分别用其处理猪卵巢颗粒细胞，24 h 后更换30 μmol/L 的ZEA 处理猪卵巢颗粒细胞，ZEA 处理后24 h。如图2 所示，0.1 和1 μmol/L 的MT 均能够显著抑制ZEA 引起的猪卵巢颗粒细胞的凋亡，且0.1和1 μmol/L 的MT 均能显著提高细胞的活力。适宜浓度的MT 可以作为一种保护剂抑制ZEA 引起的猪卵巢颗粒细胞的凋亡。

3 讨论

ZEA 是猪场饲料的主要污染物之一，母猪过量食入会攻击生殖系统，其以卵巢颗粒细胞为主要靶点，影响卵泡发育，降低母猪产仔数。Zhang 等［10］通过转录组测序发现ZEA 可通过调节lncRNA 的表达来调节细胞周期相关基因CDK1、CCNB1、CDC25A 和CDC25C 的表达，导致猪卵巢颗粒细胞周期阻滞在G2/M 期。并且ZEA 也可通过调节与细胞凋亡相关miR-744、miR-1343 和miR-331-3p的表达，从而促进细胞凋亡［11］。本研究通过使用不同浓度ZEA 处理猪卵巢颗粒细胞，发现30、50 和100 μmol/L 的ZEA 显著促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡，且呈现剂量效应关系。

图2 MT 抑制ZEA 诱导的细胞凋亡

目前，针对ZEA 诱导猪卵巢颗粒细胞凋亡的保护性化合物的研究较少。Lai 等［12］研究发现在卵泡生长液或卵母细胞成熟液中添加溶血磷脂酰胆碱可部分保护ZEA 对卵泡腔形成和卵母细胞成熟的影响。另有研究检测了20 种中药提取物对ZEA 所诱导的小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用，表明绿原酸可显著抑制ZEA 诱导的小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡［13］。由于ZEA 可导致细胞内ROS 的积累，而MT是一种广谱的细胞抗氧化剂，因此，本研究检测MT是否保护ZEA 诱导的猪卵巢颗粒细胞的凋亡，结果发现0.1 和1 μmol/L 的MT 抑制30 μmol/L 的ZEA对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响，提高细胞的活力。

本研究发现，ZEA 促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡，且呈现剂量效应关系，而MT 可抑制ZEA 诱导的猪卵巢颗粒细胞的凋亡，在养猪生产中MT 可用来预防ZEA 引起的母猪繁殖性能降低。