小分子化合物靶向DNA 连接酶IV 提高CRISPR/Cas9 基因编辑效率的研究进展

肖红卫，毕延震

（动物胚胎工程与分子育种湖北重点实验室/湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，武汉 430064）

能够在DNA 链上制造特定位点双链断裂（Double-strand breaks，DSB），并利用细胞的DNA 修复功能进行修复的技术被称之为基因编辑技术，常见的基因编辑技术有锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（TAL effector nucleases，TALEN）和CRISPR/Cas9 等，理论上基因编辑技术可以对任意细胞类型的任意基因进行定点改造。前人在研究DNA 损伤修复时发现，真核细胞会对DNA 的DSB 进行同源重组（Homologous directed recombination，HDR）、非同源末端连接（Nonhomologous end joining，NHEJ）的选择性修复，在选择HDR 修复时会依照模板进行精确地修复，而在选择NHEJ 修复结束后在这些DSB 位点造成局部的缺失、插入，甚至无关联位置末端连接等［1］。

科学家们在研究DNA 修复过程时发现，NHEJ与HDR 之间相互竞争，互为替代DNA 修复途径［2，3］。Pierce 等［4］研究发现，NHEJ 与HDR 2 种途径同时起作用，NHEJ 活性降低会增加HDR 效率。小分子化合物在DNA 修复的HDR 通路与NHEJ 通路的选择上发挥作用，并以此为指导产生了以小分子化合物来提高基因编辑效率的一系列研究。本研究通过综述分析小分子化合物在DNA 修复中NHEJ 通路中发挥的作用机制，说明小分子化合物提高CRISPR/Cas9 基因组编辑的研究进展，为基因的精确编辑提供理论依据。

1 DNA 修复中的HDR、NHEJ 机制

DNA 双链断裂的修复对于细胞维持其基因组完整性至关重要。修复哺乳动物细胞中这些断裂的2 个主要机制是非同源末端连接和同源重组。图1为NHEJ 与HDR 之间相互竞争、互为替代DNA 的修复途径［2，5，6］。

1.1 HDR 机制

HDR 在 细 胞 的S 期 起 作 用。 首 先，DSB 被MRN（Mre11p/Rad50p/Nbs1p）复合体识别，接着招募RecBCD 复合体进行DSB 断端处理，断端从5′-3′降解核苷酸，形成3′端单链DNA（ssDNA）。3′端单链DNA（ssDNA）在RecA 的作用下调整和侵入另外一条同源链从而进行后续的DNA 分子交换，形成HJ模型（Holliday Junction）。然后在RecA 和DNA 聚合酶的作用下进行DNA 碱基互补配对、DNA 合成及延伸。接着发生HJ 模型交叉支点的迁移和切断。最后，2 个双链DNA 解离，DNA 连接酶连接DNA 断端，得到2 个独立完整的双链DNA［5］。图2为HDR 修复途径的步骤以及各因子参与该过程的顺序［6］。

图2 DNA 损伤HDR 修复过程

图1 NHEJ 与HDR 之间相互竞争、互为替代DNA 的修复途径

1.2 NHEJ 机制

NHEJ 在整个细胞周期中都起作用，并且DSB被Ku70/Ku80 异二聚体识别，该异二聚体结合在断裂两侧的DNA 末端。这种异二聚体的形成导致DNA 依赖性蛋白激酶（DNA-PK）的催化亚基的活化。DNA-PKcs 与Ku70 和Ku80 结合并稳定DNA的末端。稳定后，DNA 连接酶IV（DNA ligase IV，LIG IV）/XRCC4 复合物结合并将DNA 的末端连接在一起，从而修复了DSB［7，8］。由于HDR 效率很低（＜5%），大部分DSB 都由NHEJ 修复完成，从而引进许多随机的插入和缺失。此外，HDR 的效率还与细胞的类型与状态等因素相关。 在S/G2 期间，NHEJ 和HDR 之间的路径选择受DSB 位点的最终处理程度影响［9］。图3 为经典NHEJ 途径的步骤以及各因子参与该过程的顺序［10］。

图3 经典NHEJ 途径的步骤以及各因子参与该过程的顺序

在脊椎动物细胞的NHEJ 途径中，除了MRN（Mre11p/Rad50p/Nbs1p）复合体以外，DNA 依赖性蛋 白 激 酶Ku70p、Ku80p、DNA-PKcs、Xrcc4p 和DNA ligase IV 的3 个亚基均参与非同源末端结合途径。自从Chu 等［11］发现使用DNA ligase IV 的小分子化合物抑制剂SCR7 来抑制样品的NHEJ 后可以提高HDR 的效率以来，相关研究不断深入。

2 小分子化合物通过抑制NHEJ 通路中的DNA 连接酶IV 提高HDR 通路的效率

DNA 连接酶IV 由与C 末端串联BRCT 结构域连接的N 末端催化结构域组成［12］。DNA ligase IV中的串联BRCT 结构域与XRCC4 的茎区域以高亲和力相互作用，从而稳定了DNA ligase IV［13，14］。所有细胞DNA ligase IV 都可能与XRCC4 复合存在［15，16］。

DNA ligase IV 在ATP 依赖性反应中与双链多脱氧核苷酸中的单链断裂连接。 该蛋白质通过NHEJ 对V（D）J 重 组和DSB 的修 复是必需的。DNA ligase IV 负责在NHEJ 期间密封DSB。已知XRCC4 和DNA-PK 都是NHEJ 所必需的，抑制DNA ligase IV 可导致DSB 的聚集［17，18］。

2.1 SCR7

2.1.1 SCR7 的作用机理 Srivastava 等［19］研究发现一种分子（SCR7）可以抑制DSB 在无细胞修复系统中的连接。DNA ligase IV 蛋白与X 射线修复交叉互补蛋白4（XRCC4）形成复合物，并进一步与DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）相互作用。 XRCC4、DNA-PK 蛋白上没有SCR7 分子可以结合的结构域，在DNA ligase IV 上存在DNA 以及SCR7 分子可以结合的结构域。SCR7 通过干扰其与DNA 结合而不是T4DNA 连接酶或连接酶I 的结合来阻断DNA ligase IV 介导的连接。SCR7 分子与DNA 分子竞争性地结合在DNA ligase IV 蛋白上，从而在细胞内以DNA ligase IV 依赖性方式抑制NHEJ。采用ACD ChemSketch 软件绘制了SCR7 的化学结构式，并采用Accelrys Discovery Studio 2.5 软件模拟了SCR7 与DNA ligase IV 的互作结果（图4）。

Maruyama 等［3］研究发现，通过增加外源DNA片段可以提高通过同源重组掺入基因组的速率，从而将靶向DSB 引入DNA，实现精确的基因组编辑。为了抑制NHEJ 促进HDR，使用了抑制剂SCR7 靶向DNA ligase IV（NHEJ 途径中的关键酶）。在哺乳动物细胞系和小鼠中使用CRISPR/Cas9 技术对Kell、Igkc、Os9、Sgms2 4 个基因进行基因编辑，SCR7的处理提高了HDR 介导的基因组编辑效率，在对这4 个基因进行检测时，使用SCR7 处理最高可以提高基因编辑效率达19 倍。该方法应适用于其他可定制的核酸内切酶，例如锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶，以及具有足够保守的NHEJ和HDR 机制的非哺乳动物细胞。Vartak 等［20］也发现，SCR7 通过抑制NHEJ 显著提高了精确基因组编辑的效率，并且在体外和体内均有利于无错误的同源重组途径。

图4 SCR7 的化学结构式以及SCR7 与DNA ligase IV 互作的模拟

Chu 等［11］使用了抑制剂SCR7 将HDR 的效率提高了4～5 倍。Ma 等［21］研究发现，与NHEJ 途径相比，CRISPR/Cas9 介导的HDR 指导的精确遗传修饰效率相对较低，通过添加SCR7 来抑制DNA ligase IV 从而抑制NHEJ，可以增加HDR 介导的精确遗传修饰效率。Hu 等［22］研究发现，在使用ssODNs 作为模板时，与没有SCR7 处理的细胞相比，SCR7 处理使转染细胞中的靶向插入效率提高了3 倍。而Lin等［23］研究发现，将抑制剂SCR7 引入CRISPR/Cas9系统促进了HSV-1 基因组中HDR 介导的基因置换，进一步验证了Maruyama 等［3］、Vartak 等［20］的发现。

Li 等［24］研 究 发 现，小 分 子 化 合 物SCR7、L755507 和白藜芦醇可使猪胎儿成纤维细胞的HDR 效 率 提 高2～3 倍。 当 用 同 源 模 板DNA 和CRISPR/Cas9 质粒转染并用小分子处理时，具有大DNA 片段整合的敲入猪胎儿成纤维细胞系的比率可以达到筛选细胞集落的50% 以上，而用DMSO 处理的细胞组中敲入率为26.1%。结果提示，应该存在一类结构类的并且可以提高基因编辑效率的小分子化合物。而Vartak 等［25］研究发现，环化形式的SCR7 在体外显示出对NHEJ 的强烈抑制，环化和氧化形式的SCR7 抑制DNA ligase IV 催化的DNA 末端连接，而它们对DNA ligase III、DNA ligase I 和T4DNA 连接酶介导的连接影响最小。环化和氧化形式的SCR7 均抑制V（D）J 重组，其中SCR7 环化的效果更明显。SCR7-吡嗪对细胞内的连接酶IV的特异性较低。结果提示，对小分子化合物结构的分析很重要，并可指导相关化合物的合成。

2.1.2 CRISPR/Cas9 中使用的SCR7 剂量 在确认了SCR7 对HDR 效率的提升具有确切的作用后，众多科学家对SCR7 的使用浓度进行了探索。Chu等［11］研究发现，10～60 mmol/L 的SCR7 均可有效地提高HDR 的效率。Maruyama 等［3］研究发现，使用1 mmol/L 的SCR7 注射胚胎可以提高HDR 介导的基因组编辑的效率7～19 倍。Lin 等［23］研究发现，SCR7 可以促进人类细胞中HSV-1 基因组上HDR介导的基因置换。Li 等［24］研究发现，10～200 μmol/L SCR7 不会影响细胞周期分布。用小分子处理的细胞中几乎所有的HDR 途径关键因子均表达上调。一些NHEJ 关键因素，如LIG4 和MRE11，在用L755507 或SCR7 处理后显示出mRNA 表达水平的显著降低，但是XRCC5、XRCC6 和XRCC7 这3 个NHEJ 修复通路中的关键因子在用SCR7、L755507以及Resveratrol 这3 种化合物处理的细胞中均表达上调。Hu 等［22］研究发现，与未使用SCR7 处理的细胞相比，采用SCR7 处理MCF-7 细胞和HCT-116细胞时，HDR 片段明显增加。不同的研究采用的浓度不尽相同，却都能成功完成，进一步证明了SCR7的作用。

2.2 NU7026

Gkotzamanidou 等［26］研究发现，用DSB 修复抑制剂处理细胞会显著降低DSB 修复的比率并增加细胞对木香素的敏感性，而非同源末端连接抑制剂NU7026 和SCR7 表现出最强的作用。软件分析后发现，NU7026 和SCR7 同处于DNA ligase IV 结合的结构域，推测在DNA 修复中NU7026 可能发挥和SCR7 同样的调控作用。结合NU7026 处理细胞后可以增加细胞对木香素的敏感性，推测在进行多个小分子化合物联合处理细胞时，NU7026 和SCR7 发挥了booster 的作用。采用ACD ChemSketch 软件绘制NU7026 的化学结构式（图5a），并采用Accelrys Discovery Studio 2.5 软件模拟NU7026 与DNA ligase IV 的互作结果（图5b），以及模拟NU7026、SCR7 与DNA ligase IV 的 互 作 结 果（ 图5c）。NU7026 与SCR7 同处于DNA ligase IV 结合的同一个结构域。

2.3 白藜芦醇

Li 等［24］研究发现，用白藜芦醇处理细胞后，结果根据白藜芦醇剂量的变化而变化。低浓度（小于25 μmol/L）白藜芦醇可以抑制LIG4 和XRCC4 的表达。50 μmol/L 白藜芦醇对LIG4 的表达没有影响，或略微上调了XRCC4 的表达，而100 μmol/L 白藜芦醇显著促进了它们的表达。软件分析后发现，白藜芦醇和SCR7 同处于DNA ligase IV 结合的结构域，结合白藜芦醇处理细胞后的结果，推测白藜芦醇与SCR7 可能另外调控DNA 修复的作用机制。采用ACD ChemSketch 软件绘制白藜芦醇的化学结构式（图6a），并采用Accelrys Discovery Studio 2.5 软件模拟白藜芦醇与DNA ligase IV 互作结果（图6b），并模拟白藜芦醇、SCR7 与DNA ligase IV 互作的结果（图6c）。白藜芦醇与SCR7 同处于DNA ligase IV 结合的同一个结构域。

2.4 L755507

Li 等［24］研究发 现，用L755507 处 理 细胞 后，LIG4 和MRE11 的mRNA 表达水平显著降低，而XRCC5，XRCC6 和XRCC7 表达水平均上调。软件分析后发现，L755507 没有和SCR7 同处于DNA ligase IV 结合的结构域，推测L755507 可能另外调控DNA 修复的作用机制。采用ACD ChemSketch 软件绘制的L755507 的化学结构式，并采用Accelrys Discovery Studio 2.5 软 件 模 拟L755507、SCR7 与DNA ligase IV 互作结果。 L755507 远离SCRT 与DNA ligase IV 作用的结构域（图7）。

3 其他研究

图5 NU7026的化学结构式（a）、NU7026与DNA ligase IV互作结果（b）、NU7026、SCR7与DNA ligase IV互作结果（c）的模拟

图6 白藜芦醇的化学结构式（a）、白藜芦醇与DNA ligase IV 互作结果（b）以及白藜芦醇、SCR7 与DNA ligase IV 互作结果（c）的模拟

图7 L755507 的化学结构式以及L755507、SCR7 与DNA ligase IV 互作结果的模拟

科学家们除了使用NHEJ 的小分子化合物抑制剂来抑制NHEJ 以提高HDR 的效率之外，还针对参与NHEJ 通路的各个蛋白开展了相关功能研究。Song 等［27］研究发现，HDR 增强子RS-1 的体外应用在不同位点将敲入效率提高了2～5 倍，而NHEJ 抑制剂SCR7 却只能提高2.3% 的基因编辑效率。提示除了SCR7 抑制剂之外，还有别的途径可以提高HDR 的效率。Yang 等［28］研究发现，G2/M 中的hPSCs 与ABT 阶段同步增加了目标基因编辑效率3～6倍。靶向基因编辑的增加是基因座独立的并且对细胞周期阶段是特异性的，因为与G1 期细胞相比，G2/M 期富集的细胞显示靶向效率增加6 倍。同时用SCR7 抑制NHEJ 不会增加HDR 或进一步提高基因靶向效率，表明HDR 是G2/M 期阻滞后的主要DNA 修复机制。Shao 等［29］研究发现，通过表达参与同源重组过程的基因Rad52 可以增强HDR 效率。Rad52 共表达和 Rad52-Cas9 融合策略在人HEK293T 细胞以及基因组编辑中HDR 效率增加了约3 倍。此外，还证实了Rad52-Cas9 融合对由不同供体模板（质粒、PCR 和ssDNA）介导的HDR 的增强作用，并发现通过Rad52 和SCR7 组合使用，HDR 效率可以显著提高到约40%。

4 展望

自从基因编辑技术出现后，在基因功能的研究上日益深入。该技术可以很方便地在DNA 链上产生DSB，并利用细胞自身的DNA 修复中的NHEJ 机制，在靶基因座位上产生突变；或者利用DNA 修复中的HDR 机制，把目的基因定点插入靶基因座位。该技术克服了传统转基因技术的整合随机、遗传不稳定等缺陷，具有很大的应用前景。尤其是在利用DNA 修复中的HDR 机制把目的基因定点插入靶基因座位的研究上，人们可以采用基因编辑技术，把一些药用蛋白基因敲入乳腺特异表达基因区或者输卵管特异表达基因区，使牛羊乳中产生药用蛋白或者鸡蛋中产生药用蛋白。基于CRISPR/Cas9 的基因编辑系统的研究最为简单和便宜，得到广泛的应用和推广，但因为细胞内的NHEJ 与HDR 的竞争，导致HDR 效率比较低。该问题的解决需要科学家们共同攻关，研究高效的编辑手段、筛选技术和转移方法，以促进基因编辑技术的进一步推广和应用。

利用小分子化合物靶向DNA 连接酶IV 抑制NHEJ、提高HDR 效率是热门研究的方向之一。利用筛选出的小分子化合物，不管是在DNA 修复机制研究上还是在生物工程研究上，都具有很高的价值。而该研究方向的关键点就是在参与DNA 修复NHEJ 途径的DNA 连接酶IV 上，一旦筛选出高效的DNA 连接酶IV 抑制剂，就会促进基因编辑技术在生产上的应用。