顶空气相色谱法测定磷霉素氨基葡萄糖盐残留的研究

苏小雅，马 强，张尹萌，田丽敏，杨 柳，祝 宏*

1.武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430205；

2.武汉市药物增溶工程技术研究中心，湖北 武汉 430205；

3.武汉软件工程职业学院，湖北 武汉 430205

磷霉素是天然广谱的小分子抗生素，对革兰阴性菌和格兰阳性菌具有较高的抗菌活性，磷霉素与其他多种抗生素联合使用时均有协同作用［1-3］。磷霉素独特的抗菌作用机制使得它再度成为近来被广泛关注并研究的老药之一［4-6］。磷霉素类抗生素通过干扰细胞壁的合成，从而发挥了广谱的抗菌作用［7-8］。壳寡糖是天然天然糖中唯一大量存在的碱性氨基寡糖［9］。磷霉素中作为药效团的环氧键不稳定，常以盐的形式存在从而获得较高的稳定性［10］。由于壳寡糖的聚合度和分子量不方便准确测定，故选用D-氨基葡萄糖进行合成反应制备。利用拼合原理将两种药物拼合在一起，得到的新结构可以改变原有药物的药代动力学，有利于增加药物的稳定性［11-13］。

实验室自制的磷霉素氨基葡萄糖盐，用二氯甲烷萃取磷霉素钠水溶液中的α-苯乙胺，活化后的苯乙烯树脂处理磷霉素钠水溶液，用乙醇洗脱后得到磷霉素酸，与经由强碱性阴离子交换树脂的游离氨基葡萄糖溶液混合，减压蒸馏除去部分乙醇和水，液氮预冷后经冷冻干燥得到磷霉素氨基葡萄糖盐。其中，萃取过程以及洗脱过程极易引起溶剂残留，故需对二氯甲烷及乙醇进行残留溶剂的检查。

残留溶剂的毒性及致癌作用开始引起医药界的关注［14-15］。磷霉素氨基葡萄糖盐原料药在制备过程中使用了乙醇和二氯甲烷，且重结晶也是使用乙醇纯化。根据2020 版《中国药典》中的规定要求，乙醇属第三类溶剂，二氯甲烷属第二类溶剂，故在原辅料的制备中需要对相关有机溶剂的残留指标进行控制。气相色谱法测定残留溶剂是众多药品测定残留溶剂的首选方法［16-18］。因此本实验建立了以气相色谱法来测定磷霉素氨基葡萄糖盐原料药的溶剂残留的方法，为该原料药的质量标准以及进一步的研究提供理论参考依据。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

无水乙醇（国药集团化学试剂公司），二氯甲烷（国药集团化学试剂公司）均为色谱纯（纯度＞99.8%），新盐样品为实验室自制（批号分别为2107001，2107002，2107003，2107004，2107005）。

安捷伦7890 气相色谱仪，配备火焰氢离子化检测器，7697A 顶空进样器和7693A 自动进样器；氮、氢、空一体机（北京中惠普分析技术研究所NHA-300），载气为高纯氮；Agilent GC ChemStation 色谱工作站；METTLER TOLEDO 电子分析天平；Ultra pro 超纯水机（北京广开源商贸有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：HP-5（30 m×320 μm×0.25 μm，美国Agilent 公司）；柱温：起始温度为40 ℃，维持10 min，以20 ℃/min 的速率升温至200 ℃，维持5 min；进样口温度210 ℃；检测器温度250 ℃；分流比40∶1；载气流速2.5 mL/min。顶空瓶平衡温度为85 ℃，平衡时间为30 min。

1.2.2 溶液配制 对照品溶液配制：精密称取无水乙醇1 000 mg，二氯甲烷600 mg，置于同一个100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀密封待用。供试品溶液配制：精密称定新盐样品0.25 g，溶于水中并定容至50 mL 容量瓶，摇匀密封待用。

2 结果与讨论

2.1 方法专属性试验

分别准确量取“1.2.2”项下空白溶剂，混合对照品溶剂5 mL 于20 mL 顶空瓶中，与供试品溶液按“1.2.1”的色谱条件进行测定。结果见图1，无水乙醇、二氯甲烷的保留时间分别为1.414 min 和1.560 min，2 种溶剂分离度符合要求，空白溶剂不干扰测定。

图1 专属性试验气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of specificity test

2.2 线性范围

取混合对照储备液20 mL 于100 mL 容量瓶中，加纯化水稀释并定容，摇匀待用；分别移取5，4，3，2，1 mL 分别置于5 个10 mL 容量瓶中，加水定容稀释，摇匀待用，将稀释后的容量瓶中溶液分别移取5 mL 于20 mL 顶空瓶中，密封待测。将待测成分浓度作为横坐标，峰面积为纵坐标，得到线性回归方程以及线性范围。结果见表1。

表1 乙醇，二氯甲烷的线性回归方程和线性范围Tab.1 Linear regression equation and linear range for ethanol and methylene chloride

2.3 定量限与检出限

取一定量的“1.2.2”项下配制的混合对照品溶液，然后进行稀释，稀释后的溶液按照“1.2.1”项下的色谱条件进行进样检测，以信噪比S/N=3 计算各残留溶剂的最低检出限，以信噪比S/N=10 计算各残留溶剂的最低定量限，检测出的乙醇定量限为1.5 μg/mL，检出限为0.5 μg/mL，二氯甲烷的定量限为0.6 μg/mL，检出限为0.15 μg/mL。

2.4 精密度

平行取一定量的“1.2.2”项下配制的混合对照品溶液六份，按照“1.2.1”项下的色谱条件进行检测，记录结果。结果可得，乙醇和二氯甲烷峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为4.0%，2.8%（n=6），说明该研究方法重复性良好。

2.5 加标回收率

由2020 版《中国药典》可知，乙醇和二氯甲烷残留溶剂的残留限度分别为0.5%和0.06%。分别在样品（批号：2107002）中按乙醇和二氯甲烷的残留溶剂限值的80%，100%，120%进行回收率试验并计算。计算结果见表2。

表2 回收率试验结果Tab.2 Results of recovery tests n=3

2.6 样品的含量测定

取5 批磷霉素氨基葡萄糖新盐（批号为2107001，2107002，2107003，2107004，2107005）样品，按“1.2.2”项下方法配制溶液，分别取5 mL 置于5 个顶空瓶中，密封待测，按“1.2.1”项下方法进行检测。

结果表明，5 批样品中的乙醇含量不超过规定限度，未检测出二氯甲烷的含量（见表3）。

表3 样品中有机溶剂残留量的测定结果Tab.3 Determination of residual organic solvents in samples n=3

2.7 讨 论

本实验对样品溶剂的选择进行了考察，通过比较了N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，甲醇和水4 种溶剂，发现样品在以上溶剂中只溶于甲醇和水。由于样品在水中的溶解性较好，且水的沸点都要高于乙醇和二氯甲烷的沸点，故选择水为溶剂进行样品的溶解。实验中分别试验了10∶1，20∶1，40∶1 三个分流比，通过实验过程中发现当分流比为40∶1 时，出的样品峰形较好，无明显拖尾现象。

3 结 论

本文建立了测定磷霉素氨基葡萄糖盐原料药中有机溶剂乙醇和二氯甲烷残留量的顶空气相色谱的方法，并对制备样品中的乙醇和二氯甲烷的残留量进行了检查。实验通过使用顶空气相色谱仪，对残留溶剂的系统适用性试验，线性范围，定量限，检测限，精密度和加标回收率进行考察，实验结果表明：本检测方法可适用于磷霉素氨基葡萄糖盐原料药中的有机残留溶剂的检查。原料药在合成步骤所运用到的乙醇和二氯甲烷有机溶剂的检测结果均满足2020 版《中国药典》所述的对化学有机残留溶剂的相关规定。以此方法来作为本课题组检测所合成的原料药残留溶剂的方法学和质量控制的标准，为下一步的研究以及后续药品的生产上市提供有效技术支持。