多粘类芽孢杆菌的研究进展

刘守德，刘华梅，周 莉，黄 芳，徐 广，武若楠，王小华，3，胡国元*

1.武汉工程大学环境生态与生物工程学院，湖北 武汉 430205；

2.武汉科诺生物科技股份有限公司，湖北 武汉 430074；

3.武昌理工学院生命科学学院，湖北 武汉 430223

多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa，P.polymyxa）是一类芽孢杆菌科类芽孢杆菌属的革兰氏阳性细菌，1993年由Ash等［1］将其归为类芽孢杆菌属之前又名多粘芽孢杆菌。作为类芽孢杆菌属的模式菌株P.polymyxa也是一类重要的植物根际促 生 菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）。由于既可以作为微生物肥料促进作物的生长和增产增收，又可以用作生物农药防治多种植物病害发生且使用安全无环境污染，P.polymyxa被美国环保署定为可作商用的微生物之一［2］。P.polymyxa通过固氮、溶磷、获取铁以及产生植物生长调节剂等方式来促进植物的生长发育，通过产生杀虫或杀菌活性物质和诱导植物产生系统性抗性等方式实现生物防治［3］，还可以用作底盘菌株来发酵生产如多粘菌素、β-葡聚糖、果胶酶等多种活性物质用于生物医药和工业制造等领域。目前除了多粘菌素应用较为成熟外，国内生产的与P.polymyxa相关农用及工业化产品多用于出口，对其生物防治、土壤修复、选矿、水处理的产业化应用大多仍处于实验阶段。本文综述了P.polymyxa的功能基因组研究、代谢活性物质研究及产业化应用现状，为P.polymyxa的研发与应用提供思路。

1 功能基因组研究

P.polymyxa的基因研究起步相对较晚。在全基因组测序方面典型的P.polymyxa菌株SQR21、CR1、SC2［4］、ATCC842［5］、E681［6］、M1、Sb3-1 等全长序列或部分基因草图均已录入GenBank。在基因克隆、鉴定、表达分析方面P.polymyxa已完成了多个基因的功能注释如：抗生素合成基因如E681中关于合成多粘菌素的基因簇pmxA-E［7］，菌株SQR-21 中合成镰刀菌素的基因簇fus［8］等；植物促激素相关基因如E681 中吲哚乙酸合成途径的吲哚-3-丙酮酸脱羧酶基因［9］，多种多糖相关产物合成基因如CP 7 中β-葡聚糖酶基因［10］等；肽类和聚酮类合成相关的基因等。Park 等对P.polymyxaE681 合成的羊毛硫类抗生素的基因簇进行了分析和表征，证实该新型抗生素产物可用于抑制部分革 兰 氏 阳 性 菌 的 生 长［11］。 He 等 探 究 了P.polymyxaWLY78 菌株中的pep-2基因簇与生物膜的 形 成 之 间 的 联 系［12］。 Soni 等 分 析 了P.polymyxaHK4 中部分与编码非核糖体合成肽相关的合成基因簇［13］。Wang 对P.polymyxa的泛基因组和核心基因组的进行分析后发现泛基因组是开放的，核心基因共有3 192 个。797 个次生代谢物的基因簇中有343 个与公开报道的基因簇不相似，这有望揭示大量新的次生代谢物的合成机理，此外还分析了部分高度保守的植物生长促进基因，并表明植物促生作用是P.polymyxa对相关生存环境的进化适应［14］。

2 代谢活性物质研究

除了上述功能基因编码合成的各种抗生素和植物促激素外，P.polymyxa还能产生诸如胞外多糖、拮抗蛋白、酶、核苷类等大量代谢活性物质。这些代谢活性物质具有絮凝、助悬浮、吸附重金属、抑菌、抗氧化、预防和治疗疾病等功能，具有广阔的应用前景（见表1）。

表1 多粘类芽孢杆菌的代谢活性物质Tab.1 Metabolic active substances of P.polymyxa

2.1 胞外多糖

微生物多糖是一些由真菌、细菌和藻类等代谢形成的多糖。根据其所处部位又可分为胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖。胞外多糖通常是以粘液的形式分泌到环境中或以荚膜的形式附着在细胞壁外，防止脱水和原生动物的吞食对生物体起保护作用。胞外多糖是P.polymyxa的一种重要产物，具有乳化、助悬浮、富集重金属、抗氧化和抑制肿瘤细胞生长等多方面功能。通常P.polymyxa产生的胞外多糖是由葡萄糖、半乳糖、葡聚糖、果聚糖、甘露糖、海藻糖和葡萄糖醛酸中的一种或几种组成。利用大孔树脂对P.polymyxaEJS-3 产生的胞外多糖分离和鉴定为果聚糖［15］。除果聚糖外P.polymyxa还可代谢产生β-葡聚糖［16］。研究表明从P.polymyxaNCIB 11429 的发酵液中纯化得到的杂多糖（Biopolymer PS 87）对细沙具有较好的助悬浮作用。胞外多糖有助于细胞团块的形成和微粒子的絮凝［17］，因此可利用此特性进行污水处理。Çolak 等研究了P.polymyxa对重金属的抗性和吸附性能，研究表明可吸附铜49.8 mg/g，镍35.02 mg/g［18］。此外P.polymyxaJB115 可通过MAPK 和NFJB 信号通路诱导产生NO 来激活巨噬细胞［19］以清除肿瘤，这为新型抗肿瘤药物的开发提供了思路。

2.2 抗菌物质

P.polymyxa产生具有抗菌活性的物质按分子量大小依次可分为大分子量的拮抗蛋白或酶、小分子量的肽类抗生素和核苷类物质等。抗菌活性的蛋白类物质主要由核糖体代谢途径产生，可特异性的降解宿主菌的核细胞壁。这些大分子的拮抗蛋白（酶）包括β-1，3-葡聚糖酶［20］、几丁质酶［21］、蛋白酶［22］和果胶裂解酶［23］等。此外P.polymyxa还可以产生多种不具酶活性的蛋白，但这些蛋白对特定的植物病原菌依然拥有较好的拮抗效果。如Kavith 等［24］从P.polymyxaVLB16 的发酵液中纯化到的分子量大小为37 kDa 的拮抗蛋白，对水稻纹枯病菌和稻痕病菌孢子有较好的抑制效果［25］。P.polymyxaCp-S316 可产生分子量介于6～14.2 kDa 的拮抗蛋白对辣椒炭疽病菌有很好的抑制效果。

P.polymyxa产生的小分子结构的肽类抗生素主要是经过非核糖体代谢途径由非核糖体肽类合成酶（NRPS）产生。根据其拮抗对象的不同可分为两种，第一种是对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌有抑制效果［26］并且其结构含有特征性的非蛋白氨基酸-二氨基丁酸的抗生素，包括多粘菌素、乔利肽菌素、谷丙缬丝素、丝丙亮苏缬素和polypeptins 等。第二种可对放线菌、真菌和部分革兰氏阳性细菌产生拮抗作用的抗生素，包括杀镰孢菌素、十三肽素、LI-F 抗菌素和谷天苏丙缬素等。这些肽类抗生素中具有生物防治作用的主要是十三肽素、杀镰孢菌素和多粘菌素。多粘菌素和杀镰孢菌素的结构特征、抗菌活性、作用机制及应用均有报道，而谷丙缬丝素、谷天苏丙缬素、丝丙亮苏缬素、乔利肽菌素和尼柯霉素迄今未见其详细的结构报道，这些新型抗生素的结构分析有赖于如质谱和核磁等检测分析技术的进一步发展。

P.polymyxa产生的核苷类抗菌物质主要有多氧霉素［27］等。polyoxin 的分子结构与UNP-N-乙酰葡萄糖类似，对几丁质合酶有竞争性抑制作用，通过控制真菌细胞壁成分几丁质的合成来达到抑制植物病原真菌生长的效果［28］。polyoxin 可以抑制如水稻纹枯病病原菌和梨树黑斑病等的病原菌生长。

2.3 植物激素

P.polymyxa可产 生如吲哚-3-乙酸［29］、生 长素［30］、乙烯［31］、双萜化合物类的赤霉素［32］和腺嘌呤衍生物类的细胞分裂素［33］等多种植物生长激素来促进作物生长发育。用P.polymyxaHK4 处理花生种子比对照实验组获得更高的发芽率［34］。用P.polymyxa92 处理小麦后可明显增加植物的有丝分裂，小麦的根长增加22%，根干重增加28%［35］。

2.4 其他活性物质

在分析P.polymyxa的代谢活性物质时还找到了其他应用价值较高的活性物质，如在P.polymyxa代谢产物的化学成分分析中发现了一种异黄酮类物质（金雀异黄素）。金雀异黄素具有抑制炎症、促进细胞凋亡以及调节甾体激素受体和代谢途径等作用［36］，在预防和治疗疾病方面具有广阔的前景。除金雀异黄素外Schilling 等通过CRISPR-Cas9 介导的基因编辑技术对P.polymyxa改良来生产R-，R-2，3-丁二醇，其发酵产量达到43.8 g/L［37］。R-，R-2，3-丁二醇是一种潜在的大宗平台化合物，被广泛的使用在医药、食品和燃料等领域。此外，P.polymyxa还能代谢产生羟基苯甲醛［38］、果胶裂解酶、吩嗪-1-羧酸（PCA）［39］等。由P.polymyxaSCE2 合成的吩嗪-1-羧酸对植物病原菌具有很好的抑制作用，同时兼具医用杀菌及抗肿瘤等功效。P.polymyxa代谢产生的β-葡聚糖酶和木葡聚糖酶可有效的降解非淀粉类多糖，从而扩大的微生物制造过程中的原料利用范围，其代谢通路中涉及的“元件”和“线路”也为合成生物学实现酶系的异源表达构建工程菌提供了思路。

3 应用研究

随着对P.polymyxa功能性基因组的挖掘和代谢活性物质的研究，学者们开发出了P.polymyxa在农业、工业和医药等领域的不同应用，诸如用作生物肥料、生物农药、酶的生产、抗感染和疾病预防等方面（表2）。

表2 多粘类芽孢杆菌的应用Tab.2 Application of P.polymyxa

3.1 农业应用研究

PGPR 的概念最初由Kloepper 和Schroth 所提出，是指生活在根际或根际土壤的可直接或间接促进作物生长，并提高植物抗逆性的一类微生物。其促生作用分为直接和间接作用两种，直接促生作用通常是指利用PGPR 产生的生物固氮、溶解磷和钾、产铁载体和植物激素等作用来促进植物生长。间接促生作用则是通过诱导植物抗性（induced systemic resistance，ISR），与病原菌竞争生存空间和营养资源等方式实现。作为一株重要PGPR 资源，P.polymyxa的功能包括固氮［40］、溶解磷［3］、获取铁［3］、分泌植物促激素［30］和拮抗植物病原菌［41］。由于存在固氮基因簇nif［42］P.polymyxaCR1 可在无氮培养基上生长并表现出其强大的固氮能力［43］。将松树幼苗接种至P.polymyxaP2b-2R后在氮标记的土壤混合物中生长，幼苗的氮含量及幼苗重量提升一倍［44］。P.polymyxaSX-3 通过分泌有机酸来促进土壤中磷酸钙的溶解进而提高植物对磷的吸收量，SX-3 菌株的平板实验对磷酸钙的水解圈高达7 mm［41］。P.polymyxaSQR-21 能 表达多个5～140 kDa 的载体蛋白，其中部分蛋白可以参与铁的转运［45］。郭芳芳等对P.polymyxaCF05展开了相关的植物实验，研究结果表明CF05 菌株发酵液及菌悬液对番茄幼苗有明显的促生长效果，经CF05 发酵液处理后的番茄幼苗的鲜重增加272.0%，干重增加266.7%［46］。除促进植物生长外，P.polymyxa还能分泌多种拮抗蛋白来实现生物防治作用。研究表明可利用P.polymyxaGBR-1抑制根结线虫，不同质量分数（25%～100%）的P.polymyxaGBR-1 的发酵滤液中对线虫的虫卵孵化率抑制率为84%～91%［47］。山东省科学院生物研究所从黄瓜霜霉病的蔬菜大棚中筛选到的P.polymyxaPB-2 的发酵液对葡萄霜霉病的抑制率达到了77.21%，制备的可湿性粉剂在田间应用稀释50 倍和100 倍的防效明显［28］。湖北省生物农药工程中心闵勇等对P.polymyxaNBF188 进行常温常压等离子体诱变筛选得到高产菌株NBF188-R，菌株NBF188-R 对青枯劳尔氏菌的抑制效果显著加强［48］。

3.2 工业应用研究

酶是活细胞产生的一种高效的生物催化剂，工业上通常经微生物发酵获得。P.polymyxa是多种酶制剂生产的底盘菌株。赵岩等筛选出的P.polymyxaKF-1 可用于高效生产果胶 裂解酶［49］。蒋红菊等对P.polymyxa20185 发酵生产碱性果胶酶的生产工艺做了初步探索，为其在造纸、洗涤等领域的应用奠定了基础［50］。孔庆祥等研究了P.polymyxaT 1163 的红麻干皮脱胶工艺，与天然脱胶工艺相比工时明显缩短［51］。李卫芬等研究了P.polymyxa产生β-葡聚糖的工艺，为β-葡聚糖在饲料行业的发展奠定了基础［52］。Rafigh 等利用P.polymyxaATCC 21830 首次生产卡德兰胶，获得的卡兰德胶平均分子量为170 kDa，其红外光谱、核磁光谱和X 射线衍射图与市面上的卡德兰胶的样品几乎相同［53］。在矿工业上，P.polymyxa可附着在矿物表面形成生物膜，进而分泌活性代谢物质以改变矿物的表面组成，结合产生的如有机酸、多糖等成分催化氧化还原反应来吸附和聚集重要的矿物成分。Patra 等通过电动学分析和絮凝吸附实验对P.polymyxa选择性分离黄铁矿和方铅矿的机理进行了深入探究［54］。除了生产酶制剂及多糖、苎麻脱胶、生物选矿外，P.polymyxa还可用于污水处理等领域。

3.3 医药应用研究

多粘菌素是由P.polymyxa产生的一种多肽类抗菌药物，主要用于治疗革兰氏阴性细菌如绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎杆菌等引起的感染。多粘菌素有多种异构体，目前在临床应用的主要是多粘菌素B 和多粘菌素E。此外，P.polymyxaJB115 产生的β-葡聚糖可通过诱导巨噬细胞激活来清除体内的肿瘤细胞，为抗癌药物的开发提供了思路。Liu 等发现由P.polymyxaEJS-3 产生的胞外多糖及其衍生物具有较强的还原能力及超氧自由基、羟基自由基的清除能力，并可用于抑制人胃癌细胞的增殖［55］。姬庆等通过P.polymyxa发酵转化人参产物比人参具有更好的抗肿瘤效果，通过阻断细胞之间的生物信息交流实现对人乳腺癌MCF-7 和皮肤癌A375 较好的抑制［56］，这种发酵转化人参以提升人参的疾病治疗效果的方案也可供其他天然植物的微生物转化参考。

4 结 论

关于P.polymyxa活性代谢物研究当前主要集中在多糖、多肽和部分植物促激素上，除多粘菌素、杀镰刀菌素和吲哚-3-乙酸外，其他活性物质的结构和功能及其合成途径尚不清晰。该菌与植物及与土壤中其他微生物的之间的互作机理亦未进行深入研究，P.polymyxa的分子生物学改造还有较大的空间。此外，P.polymyxa在田间应用所面临的的实际问题如环境的变化等对其使用效果的影响还需进一步探索。未来关于P.polymyxa的研究工作将围绕利用基因编辑技术等分子生物学手段实现高产菌株的改造，新型代谢活性物质的结构鉴定和功能开发，利用宏基因组学、蛋白质组学和代谢组学等手段分析多粘芽孢杆菌与植物和土壤微生物之间的互作机理来展开，进而开发出新的功能性产品和提高已有产品的应用效果。