重楼皂苷Ⅶ通过抑制NF-κB信号通路对重症急性胰腺炎大鼠急性肺损伤的保护作用

万朝辉,曾 良,周 辉,李 晶,雷长城

（1.南华大学衡阳医学院附属第二医院急诊科，湖南 衡阳 421001；2.南华大学衡阳医学院附属第三医院急诊科，湖南 衡阳 421900；3.南华大学衡阳医学院附属第二医院心血管内科，湖南 衡阳 421001）

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）发病急且快，是外科常见的腹部急性炎症疾病，主要表现为胰腺缺血和坏死，同时引发全身多器官损伤，致死率极高。常见的SAP并发症为急性肺损伤，SAP患者病死率高的主要原因之一是并发肺损伤［1-2］。因此探讨SAP的发病机制，对于预防和治疗SAP患者肺损伤至关重要。重楼为百合科重楼属植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎，是一种珍贵的中药材，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌抑菌、镇静镇痛、止血和免疫调节等作用，对肺部炎症疾病具有一定的治疗效果［3-4］。但有关重楼在SAP引发肺损伤中的作用目前尚未见相关报道。甾体皂苷是重楼的主要活性成分，本研究选取重楼皂苷Ⅶ（polyphyllinⅦ，PPⅦ）对SAP肺损伤大鼠进行治疗，观察其对SAP大鼠肺组织损伤的改善作用并探讨其可能的作用机制，为SAP的治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器75只SPF级SD大鼠，雄性，8周龄，体质量（250±20）g，由南华大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2015-0002。饲养温度15℃～25℃，相对湿度45%～55%，保持环境清洁。大鼠适应性喂养1周，术前12 h禁食，自由饮水。PPⅦ购自四川维克奇生物科技有限公司（生产批号：180907，纯度≥98%），牛磺胆酸钠购自美国Sigma公司（批号：BCBF3394V），二奎啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒和HE染色试剂盒购自上海碧云天公司，脂肪酶和淀粉酶ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白 细 胞 介 素6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，核因子-κB抑制因子α（inhibitor of nuclear factor-κBα，IκBα）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65、磷酸 化NF-κB（phosphorylated NF-κB，p-NF-κB）p65（Ser536）和GAPDH抗体均购自美国CST公司，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）凝胶制备试剂盒和洗膜缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司。全自动血气分析检测仪购自美国Beckman公司，全自动酶标仪购自美国Bio-Tek公司，全自动显微镜购自日本Nikon公司，蛋白凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 动物分组、造模和给药75只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、地塞米松组（阳性对照，2 mg·kg－1地塞米松）、低剂量PPⅦ组（50 mg·kg－1PPⅦ）和PPⅦ高剂量组（150 mg·kg－1PPⅦ），每组15只。除假手术组外，其他各组大鼠采用逆行胰胆管注射5%牛磺胆酸钠溶液（剂量：0.1 mL·100 g－1，流 速：0.2 mL·min－1）法 建 立SAP模型［5］，约15 min后观察到胰腺水肿伴有出血，提示SAP大鼠模型制备成功，随后将血管夹取下，关闭腹腔并缝合。假手术组大鼠开腹后仅翻动肠管和胆胰管，术后所有大鼠均自由饮水饮食。造模成功后开始给药干预，低和高剂量PPⅦ组大鼠分别给予50和150 mg·kg－1PPⅦ腹腔注射，地塞米松组大鼠腹腔注射2 mg·kg－1地塞米松，假手术组和模型组大鼠注射等量生理盐水，各组大鼠给药均为每天1次，连续2 d，随后处死大鼠取材。

1.3 各组大鼠动脉血中氧合指数（oxygenation index，OI）测定给药2 d后，抽取500μL动脉血，置于添加肝素的抗凝管中，采用全自动血气分析检测仪进行血气分析和记录各组大鼠动脉血氧分压（partial pressure of O2，PaO2），根据吸入气中的氧浓度分数（fraction of inspiration O2，FiO2），计算OI，OI=PaO2/FiO2。

1.4 各组大鼠肺组织湿/干质量（wet weight/dry weight，W/D）比值计算取各组大鼠右肺下叶置于滤纸上，使表面水分被充分吸干，采用电子分析天平称湿质量（W），随后置于烘箱中烘烤72 h，温度为80℃，待烘至恒定重量后取出称干质量（D），计算肺组织W/D比值。

1.5 ELISA法检测各组大鼠血清脂肪和淀粉酶水平及肺泡灌洗液（BALF）中炎症因子水平实验结束后取各组大鼠眶静脉血，3 000 r·min－1离心10 min，取上清液保存待测。同时将大鼠的右主支气管结扎，采用提前预冷的PBS灌洗肺泡，重复5次收集BALF，随后置入－20℃冰箱保存待用。采用ELISA法检测各组大鼠血清脂肪酶和淀粉酶水平及BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-18水平，参考试剂盒说明书步骤操作，采用酶标仪测定各孔吸光度（A）值，波长设为450 nm，制作标准曲线并根据标准曲线计算相应指标。

1.6 HE染色观察各组大鼠胰腺和肺组织病理形态表现取大鼠胰腺及左肺组织，置于10%多聚甲醛中固定，经梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋后制备石蜡切片并使厚度为3～4μm，随后将石蜡切片置于60℃烤箱中2 h后取出进行脱蜡和水化，采用HE染色试剂盒对切片进行染色，在显微镜下观察各组大鼠胰腺和肺组织病理形态表现。从胰腺水肿、坏死和炎症细胞浸润等方面对胰腺组织损伤程度进行评分，评分标准参考Schmidt病理学评分［6］，损伤程度由轻到重依次标记为0、1、2、3和4分，累计总分为最终损伤评分。从肺组织水肿、出血和炎症浸润等病理改变情况对肺组织损伤程度进行评分，评分标准参考Holfbauer评分［7］，损伤程度由轻到重依次标记为0、1、2、3和4分，累计总分为最终损伤评分。

1.7 Western blotting法检测各组大鼠肺组织中NF-κB信号通路相关蛋白表达水平收集各组大鼠左肺组织，配置蛋白裂解液并提前置入4℃冰箱预冷，取约1 g肺组织剪碎后加入裂解液，匀浆机制备匀浆液，4℃、4 000 r·min－1离心20 min后取上清液，BCA法进行蛋白定量，取相同质量的蛋白与上样缓冲液混合，SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜，室温以5%的脱脂奶粉封闭2 h后分别加入相应一抗IκBα、p-NF-κB p65、NF-κB p65和GAPDH于4℃孵育过夜，TBST溶液漂洗后室温孵育羊抗兔二抗2 h，TBST漂洗后采用化学发光试剂显色，采用Image-Pro Plus 6.0软件进行灰度值分析，以GAPDH为内参计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.8 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。各组大鼠动脉血OI值，肺组织W/D比值，血清脂肪酶和淀粉酶水平，BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平，肺组织中IκBα、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表达水平均符合正态分布，以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠动脉血OI值和肺组织W/D比值与假手术组比较，模型组大鼠动脉血OI值明显降低（P＜0.01），肺组织W/D比值明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，地塞米松组和高剂量PPⅦ组大鼠动脉血OI值明显升高（P＜0.01），肺组织W/D比值明显降低（P＜0.01），而低剂量PPⅦ组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠动脉血OI值和肺组织W/D比值Tab.1 OI values of arterial blood and W/D ratios of lung tissue of rats in various groups （n=15，±s）

表1 各组大鼠动脉血OI值和肺组织W/D比值Tab.1 OI values of arterial blood and W/D ratios of lung tissue of rats in various groups （n=15，±s）

*P＜0.01 vs sham operation group；△P＜0.01 v s model group.

Group Sham operation Model Dexamethasone Low dose of PPⅦHigh dose of PPⅦW/D ratio 4.27±0.81 6.30±0.95*4.65±0.75△6.11±0.79 5.02±0.61△OIvalue（P/mmHg）440.59±19.93 264.85±12.08*411.38±13.55△280.86±9.06 376.59±12.54△

2.2 各组大鼠血清脂肪酶和淀粉酶水平与假手术组比较，模型组大鼠血清脂肪酶和淀粉酶水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，高剂量PPⅦ组和地塞米松组大鼠血清脂肪酶和淀粉酶水平明显降低（P＜0.01），而低剂量PPⅦ组大鼠上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 各组大鼠血清脂肪酶(A)和淀粉酶(B)水平Fig.1 Levels of lipase(A)and amylase(B)in serum of rats in various groups

2.3 各组大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平与假手术组比较，模型组大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，高剂量PPⅦ组和地塞米松组大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显降低（P＜0.01），而低剂量PPⅦ组大鼠上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图2 各组大鼠BALF中IL-1β(A)、IL-6(B)和TNF-α(C)水平Fig.2 Levels of IL-1β(A),IL-6(B)and TNF-α(C)in BALF of rats in various groups

2.4 各组大鼠胰腺和肺组织病理形态表现假手术组大鼠胰腺组织细胞正常，未见明显异常；模型组和低剂量PPⅦ组大鼠胰腺组织水肿、腺泡细胞出现大量坏死并伴有大量炎症细胞浸润；高剂量PPⅦ组和地塞米松组大鼠胰腺组织炎症表现均得到明显改善。假手术组大鼠肺泡结构完整，肺组织未发生水肿和炎性细胞浸润；模型组和低剂量PPⅦ组大鼠肺组织出现肺泡壁变厚、间隔变大，肺间质充血、水肿并伴随大量炎性细胞浸润等损伤症状；高剂量PPⅦ组和地塞米松组大鼠肺组织损伤程度得到明显改善。与假手术组比较，模型组大鼠胰腺组织和肺组织病理评分明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，地塞米松组和高剂量PPⅦ组大鼠胰腺组织和肺组织病理评分明显降低（P＜0.01），而低剂量PPⅦ组大鼠胰腺组织和肺组织病理评分差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3、图4和表2。

表2 各组大鼠胰腺组织和肺组织病理评分Tab.2 Pathological scores of pancreas tissue and lung tissue of rats in various groups （n=15，±s）

表2 各组大鼠胰腺组织和肺组织病理评分Tab.2 Pathological scores of pancreas tissue and lung tissue of rats in various groups （n=15，±s）

*P＜0.01 vs sham operation group；△P＜0.01 v s model group.

Group Sham operation Model Dexamethasone Low dose of PPⅦHigh low dose of PPⅦPathological score Pancreas tissue 0.44±0.15 9.65±0.60*4.25±0.18△8.94±0.51 5.85±0.44△Lung tissue 0.35±0.11 7.78±0.53*3.88±0.20△7.02±0.65 4.12±0.39△

图3 各组大鼠胰腺组织病理形态表现（HE，×200）Fig.3 Pathomorphology of pancreas tissue of rats in various groups（HE,×200）

图4 各组大鼠肺组织病理形态表现（HE，×200）Fig.4 Pathomorphology of lung tissue of rats in various groups（HE,×200）

2.5 各组大鼠肺组织中NF-κB信号通路相关蛋白表达水平与假手术组比较，模型组大鼠肺组织中IκBα和p-NF-κB p65蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，地塞米松组和高剂量PPⅦ组大鼠肺组织中IκBα和p-NF-κB p65蛋白表达水平明显降低（P＜0.01），而低剂量PPⅦ组大鼠上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

图5 各组大鼠肺组织中NF-κB信号通路相关蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）Fig.5 Electrophoregram（A）and histogram(B)of expressions of NF-κB signaling pathway related proteins in lung tissue of rats in various groups

3 讨 论

目前临床上治疗SAP的药物不良反应较多，并发症较多，效果不显著。近年来，中药治疗SAP已经有了大量的探索和进展，且出现了许多新亮点，在临床治疗方面显现出独特优势［8-9］。重楼提取物能通过调节免疫活性物质和炎症因子起到良好的抗炎作用［10-11］，这使得重楼皂苷治疗SAP成为可能。有研究［12-13］显示：当NF-κB被激活后机体炎症反应爆发，各脏器组织被进一步损伤并参与肺损伤的发病机制，提示NF-κB信号通路可能是SAP肺损伤中极其重要的一个环节。本研究结果显示：PPⅦ可通过抑制NF-κB信号通路的转导，减轻肺部炎症症状，改善SAP肺损伤大鼠的肺功能。

SAP发生后对胰腺的主要病理损伤表现为腺泡结构破坏和炎症细胞大量浸润等，本研究参考前期研究［14］采用逆行胆管注射牛磺胆酸钠制备SAP大鼠模型，HE病理染色结果显示模型大鼠胰腺组织腺泡细胞大量坏死，伴有大量炎性细胞浸润，与胰腺炎的病理特征相似，提示SAP模型大鼠制备成功。本研究中肺组织HE染色结果显示：模型组大鼠肺部还伴有肺泡壁增厚、肺间质水肿、间隔变宽及炎性细胞浸润的病理特征，同时大鼠肺组织W/D比值升高、动脉血OI值明显降低，表明SAP不仅引起大鼠胰腺组织损伤，还可诱发大鼠肺组织损伤，提示SAP肺损伤模型制备成功。进一步的研究结果显示：给予高剂量PPⅦ治疗SAP大鼠后，大鼠胰腺组织和肺组织损伤程度明显降低，肺组织W/D比值降低，动脉血OI值升高，与阳性药物地塞米松的治疗效果相当，提示PPⅦ能改善SAP引发的肺损伤。

血清脂肪酶和淀粉酶水平是SAP的重要诊断指标。研究［15-16］显示：SAP大鼠血清脂肪酶和淀粉酶水平均明显高于正常组。在SAP的发病过程中，血液中的肠源性内毒素水平会在短时间内迅速升高，同时肺泡巨噬细胞会产生多种炎性因子，引发一系列的炎症级联瀑布反应［17］。毛峥嵘等［18］研究显示：SAP患者血清TNF-α和IL-6水平明显升高，治疗后血清TNF-α和IL-6水平降低，提示肺损伤后的重要表现之一是伴随大量中性细胞浸润。本研究结果显示：模型组大鼠血清脂肪酶和淀粉酶水平及BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显高于假手术组，提示SAP大鼠肺组织炎性损伤，而给予高剂量PPⅦ干预后，SAP大鼠血清脂肪酶和淀粉酶水平以及BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显降低，提示PPⅦ可能通过抑制肺组织炎性细胞浸润，降低炎症因子水平从而缓解肺组织损伤。

SAP多器官功能不全综合征的关键始动因素是炎症反应的爆发和失控，故治疗SAP的关键点在于及时阻断炎症反应的发生。NF-κB作为调控炎症反应的转录因子，可调控各种促炎基因的翻译表达，其中p65是NF-κB介导促炎效应的一个主要亚基［19］。通常情况下核因子κB抑制因子（inhibitor of nuclear factor-κB，IκB）能 抑 制NF-κB，使NF-κB以非活性状态存在于细胞质中，受到外界刺激后IκB发生磷酸化而被激活，对NF-κB抑制作用也解除，使其可以磷酸化后进入细胞核内，促进靶基因的转录［20-21］。本研究结果显示：模型组大鼠肺组织中IκBα和p-NF-κB p65蛋白表达水平明显高于假手术组，说明NF-κB信号通路被激活，与既往研究［22-23］结论一致，而给予高剂量PPⅦ治疗后，大鼠肺组织中IκBα和p-NF-κB p65蛋白表达水平明显降低，表明PPⅦ可能通过抑制NF-κB信号通路，降低肺组织中炎性细胞因子水平，从而发挥对SAP大鼠肺组织的保护作用。

综上所述，PPⅦ可通过抑制NF-κB信号通路介导的促炎因子分泌，缓解SAP大鼠胰腺组织和肺组织损伤，从而发挥对SAP肺损伤的保护作用。