miR-1271-5p靶向FSCN1对肺癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响

龙健 邹靖 潘险峰 (荆州市中心医院肿瘤科，湖北 荆州 434020)

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一〔1〕。非小细胞肺癌约占肺癌总数的85%，尽管手术治疗、辅助化疗在一定程度上改善了肺癌治疗现状，但由于发病隐匿，大多数患者被诊断为肺癌晚期且伴有远端转移，总体5年存活率≤18%〔2〕。因此，寻找新的靶点抑制肺癌细胞的侵袭转移是肺癌治疗的关键。研究显示微小RNA(miRNA)在肺癌侵袭转移中发挥至关重要的作用〔3〕。研究显示miR-1271-5p在多发性骨髓瘤、肾细胞癌等恶性肿瘤中发挥抑癌基因，上调miR-1271-5p表达可抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡〔4,5〕。然而目前未有miR-1271-5p在肺癌中作用的相关研究。肌动蛋白束蛋白(FSCN)1是一保守的细胞骨架蛋白，其可促进活细胞表面线状突起的形成及细胞内F肌动蛋白组织排列成微丝束，增加细胞的运动能力〔6〕。FSCN1在肺癌组织中明显上调，其可能通过参与上皮间质转化过程促进肺癌转移〔7〕。生物信息学分析显示FSCN1是miR-1271-5p的潜在靶基因，但miR-1271-5p能否靶向FSCN1参与对肺癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的调控尚未可知。本研究旨在揭示miR-1271-5p调控肺癌细胞增殖、侵袭、迁移的分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 收集2015年1月至2017年1月荆州市中心医院进行肺癌切除的新鲜肺癌组织和与其对应的癌旁组织20例，术后经病理检查确诊。男14例，女6例，年龄48～76岁，平均61.5岁。所有患者术前未接受放化疗。组织标本离体后迅速置于液氮中冷冻后置于-80℃保存。人肺癌细胞A549购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；DMEM、胎牛血清及青链霉素双抗购于美国Hyclone公司；模拟物阴性对照(miR-NC)、miR-1271-5p模拟物(miR-1271-5p mimics)、小干扰RNA阴性对照(si-NC)、FSCN1小干扰RNA(si-FSCN1)、空载体质粒(pcDNA)、FSCN1过表达载体(pcDNA-FSCN1)、含FSCN1 3′UTR的野生型荧光素酶报告基因载体(WT-FSCN1)或突变型荧光素酶报告基因载体(MUT-FSCN1)由上海生工生物工程有限公司提供；四甲基偶氮唑蓝(MTT)细胞活力检测试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购于上海碧云天生物技术公司；Transwell小室和基质胶购于美国BD公司；鼠源FSCN1抗体、兔源细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9抗体、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG购于美国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人肺癌细胞A549用含10%胎牛血清和1%青链霉素双抗的DMEM培养基在37℃、5%CO2细胞培养箱进行培养，取对数期长势良好的细胞进行后续实验。

1.2.2细胞转染和实验分组 将A549细胞按照1×104个/孔的密度接种于96孔板，按照脂质体转染试剂LipofectamineTM2000使用说明分别将miR-NC、miR-1271-5p mimics、si-NC、si-FSCN1分别转染至A549细胞，依次记为miR-NC组、miR-1271-5p组、si-NC组、si-FSCN1组，转染成功后，检测细胞活力、迁移侵袭能力及相关蛋白表达水平。为证实miR-1271-5p是通过下调FSCN1表达进而影响A549细胞的增殖、迁移和侵袭，将miR-1271-5p mimics分别与pcDNA-FSCN1、pcDNA共转染至A549细胞，依次记为miR-1271-5p+pcDNA组、miR-1271-5p+pcDNA-FSCN1组，检测A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力变化。

1.2.3RT-qPCR检测miR-1271-5p和FSCN1 mRNA的表达水平 待细胞按照上述分组进行干预后，收集各组细胞，用Trizol试剂提取总RNA，紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，使A260与A280比值为1.8～2.1之间。按照逆转录试剂盒合成cDNA，并以其为扩增模板进行RT-qPCR。分别以U6和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，运用2-ΔΔCt法分析miR-1271-5p和FSCN1 mRNA的表达水平。引物序列如下：U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′；GAPDH上游引物5′-TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′，下游引物5′-GCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT-3′；miR-1271-5p上游引物5′-CTTGGCACCTAGCAAGCAC-TCA-3′，下游引物5′-GCGAGCACAGAATTAATAC-GAC-3′；FSCN1上游引物5′-TCAGAGCTCTTCCTCATGAAGCT-3′，下游引物5′-GTCCAGTATTTGCCTGTGGAGTC-3′。

1.2.4MTT实验检测细胞活力 将A549细胞按照1×104个/孔的密度接种于96孔板，按照上述细胞分组进行相应转染后，分别在转染24、48、72 h时向每孔加入20 μl的MTT试剂，培养箱避光孵育4 h，小心弃去上清液，加入150 μl的二甲基亚砜(DMSO)溶解，振荡10 min，使用酶标仪检测490 nm波长处各孔的吸光度值。

1.2.5Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力 侵袭实验：将基质胶(50 mg/L)按照1∶8稀释后铺于小室内风干后备用。将小室至于24孔板中。收集转染48 h的各组细胞，消化后，无血清细胞培养基调整细胞浓度。向小室内加入300 μl细胞数约为5×104个细胞悬液，24孔板下室加入600 μl含20%胎牛血清的培养基，37℃孵育24 h，棉签擦去未过膜细胞，4%多聚甲醛室温固定10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，结晶紫染色5 min，PBS清洗后，将小室倒置于显微镜下拍照，随机选取5个视野拍照，记录细胞总数，取均值为侵袭细胞数。迁移实验采用未包被基质胶的小室，其他步骤同侵袭实验。

1.2.6Western印迹检测FSCN1、CyclinD1、p21、MMP-2和MMP-9表达水平 待细胞按照上述分组进行干预后，收集各组细胞，加入细胞裂解液于冰上作用30 min。12 000 r/min离心30 min收集上清液，利用BCA法测定蛋白浓度。将蛋白与上样缓冲液混合后100℃变性3 min。每孔道加入30 μg细胞蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞蛋白。将所有已分离的细胞蛋白电转至硝酸纤维素膜。将膜至于5%脱脂牛奶中室温封闭1 h。洗膜后，将膜置于Ⅰ抗稀释液中4℃孵育过夜，洗膜后，将膜至于Ⅱ抗稀释液中室温孵育2 h。洗膜后，将膜至于显色液中进行避光显色，Imagel J软件分析目的蛋白的表达水平。

1.2.7双荧光素酶报告实验 StarBase预测显示miR-1271-5p与FSCN1的3′UTR区域存在部分连续互补的核苷酸序列，推测FSCN1是miR-1271-5p的靶基因并进行验证。将miR-1271-5p mimics、miR-NC分别与WT-FSCN1或MUT-FSCN1共转染至A549细胞，转染48 h检测细胞荧光素酶活性变化。同时将miR-NC、miR-1271-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-1271-5p共转染至A549细胞，转染48 h，按照1.2.6步骤检测FSCN1蛋白的表达水平。

1.3统计学方法 采用SPSS18.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1miR-1271-5p和FSCN1在肺癌组织中的表达 与癌旁组织比较，肺癌组织中miR-1271-5p的表达水平显著降低，FSCN1 mRNA和FSCN1蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。见表1、图1。

2.2miR-1271-5p过表达对肺癌A549细胞增殖的影响 与miR-NC组比较，miR-1271-5p组A549细胞miR-1271-5p的表达水平显著升高，细胞在48、72 h细胞活力显著降低，CyclinD1蛋白表达显著降低，p21蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图2、表2。

表1 miR-1271-5p和FSCN1在 肺癌组织中的表达

图1 FSCN1蛋白表达

图2 增殖相关蛋白表达

表2 miR-1271-5p过表达对肺癌A549细胞增殖的影响

2.3miR-1271-5p过表达对肺癌A549细胞迁移、侵袭的影响 与miR-NC组比较，miR-1271-5p组A549细胞迁移和侵袭细胞数目显著减少，MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见图3、表3。

图3 迁移侵袭相关蛋白表达

2.4干扰FSCN1表达对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的影响 与si-NC组比较，si-FSCN1组A549细胞FSCN1蛋白表达显著降低，细胞在48、72 h细胞活力显著降低，迁移和侵袭细胞数目显著减少，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平显著降低，p21蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图4、表4。

表3 miR-1271-5p过表达对肺癌A549 细胞迁移、侵袭的影响

图4 FSCN1和增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达

表4 干扰FSCN1表达对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的影响

2.5miR-1271-5p靶向调控FSCN1的表达 采用生物信息学分析工具StarBase进行靶基因预测发现miR-1271-5p与FSCN1的3′UTR区域存在部分连续互补的核苷酸序列，见图5A。双荧光素酶报告实验显示，相较于miR-NC和WT-FSCN1共转染组，miR-1271-5p mimics和WT-FSCN1共转染组A549细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；相较于miR-NC和MUT-FSCN1共转染组，miR-1271-5p mimics和MUT-FSCN1共转染组A549细胞荧光素酶活性无统计学差异(P>0.05)，见表5。与miR-NC组(0.59±0.05)比较，miR-1271-5p组A549细胞FSCN1蛋白表达水平(0.23±0.03)显著降低(P<0.05)；与anti-miR-NC组(0.57±0.06)比较，anti-miR-1271-5p组A549细胞FSCN1蛋白表达水平(0.95±0.08)显著升高(P<0.05)，见图5B。提示miR-1271-5p靶向负性调控FSCN1表达。

A:FSCN1的3′UTR中含有与miR-1271-5p互补的核苷酸序列；B：FSCN1蛋白表达；1，2：anti-miR-NC组，anti-miR-1271-5p组图5 miR-1271-5p靶向调控FSCN1的表达

表5 双荧光素酶报告实验

2.6FSCN1过表达逆转了miR-1271-5p过表达对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的作用 与miR-1271-5p+pcDNA组比较，miR-1271-5p+pcDNA-FSCN1组A549细胞FSCN1蛋白表达水平显著升高，细胞在48、72 h细胞活力显著升高，迁移和侵袭细胞数目显著增加，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著升高，p21蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)。见表6、图6。

表6 FSCN1过表达逆转了miR-1271-5p过表达对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的作用

1～2：miR-1271-5p+pcDNA组; miR-1271-5p+pcDNA-FSCN1组图6 FSCN1和增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达

3 讨 论

miRNA调控多种细胞增殖、转移等生理病理过程，其表达异常与癌症发生密不可分。已报道多种miRNA在肺癌中表达异常，与肺癌细胞的增殖、转移和耐药有关。Yan等〔8〕研究发现miR-24-3p在肺癌中表达上调促进肺癌细胞的增殖和迁移及小鼠异种移植肿瘤生长；Wu等〔9〕指出miR-195高表达与非小细胞肺癌患者预后不良关系密切，miR-195高表达可提高非小细胞肺癌细胞的放射敏感性；Li等〔10〕发现miR-182在转移性非小细胞肺癌中经常下调，上调miR-182可抑制肿瘤迁移、侵袭及上皮间质转化。

研究指出miR-1271-5p在肝癌组织中呈低表达，与肿瘤大小，肿瘤淋巴结转移分期和血管侵犯相关，过表达miR-1271-5p可抑制肝癌细胞的生长和迁移，miR-1271-5p是肝癌治疗的潜在策略〔11〕；在急性髓细胞白血病中miR-1271-5p显著下调，miR-1271-5p过表达可抑制白血病细胞增殖，诱导细胞凋亡，是急性髓细胞白血病预后标志物〔12〕；此外，miR-1271-5p的异常表达与结肠癌细胞对布罗莫结构域抑制剂JQ1的耐药有关〔13〕。本研究结果提示miR-1271-5p可抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭。

FSCN1是一种55 kD的肌动蛋白结合蛋白，与丝状足和肌动蛋白为基础的突起形成相关，促进细胞运动、迁移和侵袭。在正常上皮细胞中FSCN1表达缺失或低表达，但在上皮性卵巢癌〔14〕、结直肠癌〔15〕等多种恶性肿瘤中FSCN1表达上调。此外，研究证实干扰FSCN1表达可抑制胰腺癌〔16〕、肝癌〔17〕细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。与前人〔7〕研究发现一致，本研究结果提示miR-1271-5p通过靶向FSCN1在肺癌中发挥抑癌基因作用。miR-200b〔18〕、miR-145〔19〕等多种miRNA通过靶向下调FSCN1抑制肺癌的迁移、侵袭支持了本研究观点。

综上，miR-1271-5p在肺癌中表达下调，FSCN1表达上调。上调miR-1271-5p通过靶向FSCN1抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。因此，miR-1271-5p有望成为肺癌诊断和治疗的有效靶点。