miR-1915-3p和Bcl-2在结肠癌组织中的表达及其临床意义

姚晓慧

辽宁省朝阳市第二医院病理科，辽宁朝阳 122000

近年来学者发现，微小RNA（miRNA）异常表达可能和多种恶性肿瘤的发生、 发展以及预后密切相关[1-3]。其属于一类长度为21～25 个核苷酸的单链非编码RNA，对多种促癌基因和（或）抑癌基因的表达起到调控作用，继而于细胞分化、增殖、凋亡、侵袭以及转移等过程中起着至关重要的作用[4]。miR-1915-3p属于miRNA 家族重要成员之一，在多种肿瘤中均存在异常低表达，但关于其和结肠癌的相关研究并不多见[5]。Bcl 是目前临床上研究较为广泛的一种凋亡相关性基因，可有效抑制细胞中程序性细胞凋亡，继而诱发恶性肿瘤，可作为一种肿瘤分子标志物[6]。鉴于此，本研究通过探讨miR-1915-3p 及Bcl-2 在结肠癌组织中的表达及作用意义，旨在为结肠癌的诊治以及预后评估提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年2月至2016年2月辽宁省朝阳市第二医院收治的85 例结肠癌患者作为研究对象。采集所有患者癌组织及癌旁正常组织。其中男46 例，女39 例；年龄34～79 岁，平均（57.31±10.26）岁；肿瘤部位：左半结肠37 例，右半结肠48 例；肿瘤直径2.0～7.8 cm，平均（5.32±1.26）cm；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期44 例；分化程度：低分化34 例，中高分化51例；淋巴结转移36 例。纳入标准[7]：①所有患者均经病理检查确诊；②入院前尚未接受相关抗肿瘤治疗；③均为成年人；④临床病历资料完整。排除标准：①伴有其他恶性肿瘤者；②意识障碍或伴有精神疾病者；③因故无法完成相关研究/检查者。所有患者及其家属均知情同意；本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 仪器及试剂 RT-qPCR 仪（购自德国Roche Diagnostics GmbH 公 司），Nanodrop 2000分光光度计（购自上海土森视觉科技有限公司）。石蜡包埋组织miRNA 提取试剂盒选用上海联迈生物工程有限公司相关产品；TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒以及RTqPCR 试剂盒均选用美国Thermo Fisher Scientific 公司相关产品；相关引物均由上海生工生物工程股份有限公司提供。

1.2.2 检测方式 分别制备厚度为4 μm 的结肠癌以及癌旁正常组织切片，根据miRNA 提取试剂盒说明书完成总RNA 的提取。以Nanodrop 2000 分光光度计完成RNA 样品260 nm 处吸光度值以及280 nm 处吸光度值，以两者比值1.8～2.1 为宜。取1 μg 的总RNA记作模板，采用TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒获取cDNA。再取2 μl 的cNDA 作为模板实施RTqPCR 检测，检测miR-1915-3p 时，将U6 作为内参；检测Bcl-2 时，将GAPDH 作为内参。引物序列如下：miR-1915-3p 正向引物5′-CAGACGACCATCAGCCCCAGGGCGA-3′，反向引物5′-CGCGGATCCATGTCTATTATTACAG-3′。U6 正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物5′-CGTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。Bcl 正向引物5′-AGTGGGATGCGGGAGATGT-3′，反向引物5′-CGGGCTGGGAGGAGAAGA-3′。GAPDH 正向引物5′-CATTCAAGACCGGACAGAGG-3′，反向引物5′-ACATACTCAGCACCAGCATCACC-3′。反应条件如下：95℃预变性10 min；95℃10 s；60℃1 min；72℃30 s；共40 个循环。以2-△△Ct法计算目的基因mRNA 相对表达量。

1.3 观察指标

比较不同组织中miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA表达，分析结肠癌患者临床病理特征（包括年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径、TNM 分期、分化程度以及淋巴结转移）和miR-1915-3p mRNA 表达水平的关系。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA 表达水平的比较

结肠癌组织中miR-1915-3p mRNA 表达水平低于癌旁正常组织，而Bcl-2 mRNA 表达水平高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 不同组织中miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA 表达水平的比较（±s）

表1 不同组织中miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA 表达水平的比较（±s）

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2.2 不同病理特征结肠癌患者的miR-1915-3p、Bcl-2 mRNA 表达水平的比较

TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化程度及淋巴结转移的结肠癌患者miR-1915-3p mRNA 表达水平低于Ⅰ～Ⅱ期、 中高分化程度及无淋巴结转移结肠癌患者，而Bcl-2mRNA 表达水平高于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化程度及无淋巴结转移结肠癌患者，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 不同病理特征结肠癌患者的miR-1915-3p、Bcl-2 mRNA 表达水平的比较（±s）

表2 不同病理特征结肠癌患者的miR-1915-3p、Bcl-2 mRNA 表达水平的比较（±s）

项目 例数 miR-1915-3p t 值 P 值 Bcl-2 t 值 P 值年龄（岁）＜60≥60性别0.480 0.632 0.113 0.910 45 40 0.861±0.219 0.840±0.213 7.233±1.585 7.194±1.592 0.709 0.480 0.288 0.774男女46 39 0.867±0.220 0.834±0.206 7.241±1.590 7.143±1.526肿瘤部位左半结肠右半结肠肿瘤直径（cm）＜5≥5 TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期分化程度低分化中高分化淋巴结转移0.848 0.399 0.253 0.801 37 48 0.877±0.224 0.837±0.209 7.254±1.603 7.166±1.578 0.991 0.324 1.135 0.260 32 53 0.883±0.228 0.835±0.209 7.141±1.501 7.543±1.629 3.735＜0.001 6.096＜0.001 41 44 0.938±0.279 0.751±0.174 6.120±1.456 8.245±1.734 4.264＜0.001 5.722＜0.001 34 51 0.723±0.166 0.935±0.256 8.348±1.759 6.367±1.422 5.041＜0.001 6.390＜0.001是否36 49 0.709±0.147 0.955±0.264 8.513±1.785 6.234±1.497

2.3 不同预后结肠癌患者的miR-1915-3p、Bcl-2 mRNA 表达水平的比较

对所有患者进行为期5年的随访，其中死亡42例，存活43 例，死亡患者的miR-1915-3p mRNA 表达水平低于存活患者，而Bcl-2 mRNA 表达水平高于存活患者，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

表3 结肠癌患者不同预后的miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA 表达水平比较（±s）

表3 结肠癌患者不同预后的miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA 表达水平比较（±s）

预后 例数 miR-1915-3p Bcl-2死亡存活t 值P 值42 43 0.741±0.202 0.954±0.236 4.466＜0.001 8.145±1.626 6.378±1.421 5.338＜0.001

3 讨论

由于结肠癌往往发病具有极强的隐匿性，早期诊断率不高，绝大部分患者一经确诊便已处于进展期，甚至已发生淋巴结以及远处器官转移，预后不良。因此，如何有效早期诊断结肠癌显得尤为重要，亦是临床关注的热点。肠镜检查是国内外公认的诊断结肠癌金标准，但该检查方式会对患者造成一定的创伤，临床推广普及存在局限性。随着近年来相关研究的日益深入，有学者发现结肠癌的发生、发展可能涉及多基因的多阶段、多步骤的复杂过程[8]。

本研究结果显示，结肠癌组织中miR-1915-3p mRNA 表达水平低于癌旁正常组织，而Bcl-2 mRNA表达水平高于癌旁正常组织（P＜0.05）。提示miR-1915-3p 在结肠癌组织中低表达，而Bcl-2 在结肠癌组织中高表达。考虑原因，miRNA 异常表达于结肠细胞分化、 增殖以及凋亡过程中起着至关重要的作用，而miR-1915-3p 是miRNA 家族重要成员之一，介导了生物体的氧化应激、免疫细胞增殖及衰老以及干细胞自我更新等过程中，并通过对多种癌基因的表达进行调控，继而促进了结肠癌的发生、发展[9-10]。Bcl-2 属于癌基因家族成员之一，亦是一种凋亡基因，其表达的异常升高会导致机体内抗凋亡因子以及促凋亡因子之间的平衡被打破，继而引发结肠癌[11-12]。此外，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、 分化程度为低分化以及淋巴结转移结肠癌患者miR-1915-3p mRNA 表达水平低于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、 分化程度为中高分化以及无淋巴结转移结肠癌患者；而Bcl-2 mRNA 表达水平高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、 分化程度为中高分化以及无淋巴结转移结肠癌患者（P＜0.05）。有研究报道得以佐证[13]：结肠癌组织中miR-1915-3p 及Bcl-2 的表达和患者临床分期、分化程度以及淋巴结转移密切相关。究其原因，miR-1915-3p 可结合至Bcl-2 中3，-UTR 上 的1249～1255 位点，进一步对Bcl-2 的表达产生抑制，从而发挥抑癌作用。而当miR-1915-3p 表达下降时，其对Bcl-2 表达的抑制作用随之减弱，继而促进了结肠癌患者病情的进展以及肿瘤细胞的侵袭、转移。任宇鹏等人的研究报道表明[14]，Bcl-2 表达和结肠癌患者肿瘤大小有关，即肿瘤直径＞5 cm 患者的Bcl-2 表达高于肿瘤直径≤5 cm 患者。这和本研究结果存在一定的差异，导致上述差异的原因可能和检测Bcl-2表达的方式不同有关。另外，对所有受试者均进行为期5年的随访，死亡患者42 例，存活患者43 例，其中结肠癌死亡患者miR-1915-3p mRNA 表达水平低于存活患者，而Bcl-2 mRNA 表达水平高于存活患者（P＜0.05）。这反映了随着miR-1915-3p 表达水平的下降以及Bcl-2 表达水平的升高，结肠癌患者预后较差。分析原因，miR-1915-3p 的降低促使其抑制Bcl-2表达的作用下降，进一步导致抗凋亡以及抑制凋亡平衡被打破，最终抑制了结肠癌的凋亡，促进病情的进展，增加临床治疗难度，对预后产生不良影响[15]。然而，本研究亦存在一定的不足之处，如本研究在对结肠癌和miR-1915-3p 及Bcl-2 关系分析过程中仅比较了表达水平，未深入开展其他方面的研究，此举可能导致研究结果发生轻微偏倚。因此，在今后的研究中可考虑进行影响因素或相关性等方面的分析，以获取更为准确、可靠的数据。

综上所述，临床实际工作中可能通过检测miR-1915-3p 及Bcl-2 的表达水平，继而辅助临床诊断结肠癌，并对患者病情以及预后进行评估。