miR-100 过表达通过增强AMPK-mTOR-p70S6K 信号通路介导的自噬发挥抗脓毒症作用的研究

王艳鹏 黄世恩 陈志明

脓毒症是一种由于感染引起的组织损伤性疾病，作为重症监护室的主要致死因素之一，其死亡率高达30%～50%[1]。脓毒症所引起的心肌损伤以及心脏功能障碍是高死亡率的主要原因。目前认为，脓毒症的发病首先激活机体的天然免疫系统，天然免疫细胞分泌大量的炎症因子，组成炎症免疫的级联反应，进而引起包括心脏在内的多器官损伤[2-3]。脓毒症的发生是一个促炎和抗炎共同作用的结果，典型的脓毒症发病过程首先是促炎作用占据主导，多种免疫细胞释放炎症介质来激活机体的抗感染能力，同时还可激活适应性免疫系统来增强机体的免疫强度[4-5]。因此，有效抑制机体的“炎症风暴”，是治疗脓毒症及控制脓毒症器官损伤的重要手段。microRNA 是体内一类非编码小RNA，通过与mRNA 的3'UTR 配对，抑制靶基因翻译或降解靶基因[6]。单一的microRNA可能调控多个靶基因，同一个基因也可同时受控于多个microRNA，构成一个复杂的调控网络。miR-100是microRNA 中的重要成员。有研究指出，miR-100可以通过上调血管内的自噬水平，从而发挥抑制血管炎症反应的作用[7]。本研究通过构建体外脓毒症心肌细胞模型，研究miR-100 在脓毒症中的作用，并进一步探究其发挥作用的相关机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 脂多糖（LPS）购买自上海Sigma 公司（批号SMB00704）；ELISA 试剂盒购买自美国Thermo Fisher Scientific 公司[白介素-1β（IL-1β）：批号BMS630TEN，白介素-6（IL-6）：批号ERA31RBX5，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）：批号ERA56RBX5）；TRIzol试剂购买自美国 Thermo Fisher Scientific 公司（批号15596026）；miRNA 第一链cDNA 合成（茎环法）试剂盒购买自生工生物工程（上海）有限公司（批号B532453）；p62（批号PA5-115712），LC3（批号PA1-16931），beclin-1（批号PA1-16857），AMPK（批号MA5-15815），p-AMPK（批号PA5-104982），mTOR（批号PA5-34663），p-mTOR（批号PA5-104898），p70S6K（批号PA1-31167）和p-p70S6K（批号MA5-15202）抗体购买自美国Invitrogen 公司。荧光显微镜（日本尼康Nikon 公司）；PVDF 膜（美国Millipore 公司）。

1.2 细胞培养及分组 心肌细胞H9C2 来自美国组织培养物保藏中心（ATCC）。使用 DMEM 培养基（含10%胎牛血清）在5% CO2、37℃的恒温细胞培养箱中培养心肌细胞H9C2。1μg/mL LPS 刺激心肌细胞H9C2 24h 构建脓毒症体外细胞模型[8]。细胞分为以下四组：对照组、LPS 组、LPS+miR-100 激动剂组和LPS+miR-100 拮抗剂组。将正常培养的心肌细胞作为对照组，LPS 刺激的心肌细胞作为LPS 组，LPS+miR-100 激动剂组为在H9C2 细胞内转染miR-100激动剂并用LPS 造模，LPS+miR-100 拮抗剂组为在H9C2 细胞内转染miR-100 拮抗剂并用LPS 造模。

1.3 miR-100 水平检测 使用TRIzol 试剂从心肌细胞H9C2 中提取总RNA（含miRNA）。使用紫外分光光度计测定RNA 的纯度和浓度。使用miRNA 第一链cDNA 合成（茎环法）试剂盒进行逆转录。采用SYBR Green 荧光染料法进行qRT-PCR。miR-100定量PCR 的正向引物（5'→3'）序列为GCGAACCCGTAGATCCGAA，反向引物（5'→3'）序列为AGTGCAGGGTCCGAGGTATT，U6 为内参基因。用2-ΔΔCt法计算miR-100 相对表达水平。

1.4 炎症因子水平检测 收集心肌细胞H9C2 培养液上清，用于检测IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表达水平。严格按照试剂盒说明书要求，使用ELISA 试剂盒测量培养液上清中的炎症因子表达。

1.5 自噬相关蛋白LC3 的细胞免疫荧光 心肌细胞H9C2 首先用4%多聚甲醛固定，再用0.5%Triton-X 渗透，LC3 抗体在4℃孵育过夜后进行荧光二抗孵育，随后DAPI 染色。最后，在荧光显微镜下采集并分析荧光图像。

1.6 自噬相关蛋白和AMPK-mTOR-p70S6K 通路相关蛋白水平检测 细胞裂解液裂解心肌细胞H9C2后，低温高速离心获得蛋白上清。通过10% SDSPAGE 分离蛋白质，然后转移到PVDF 膜。首先用5%脱脂奶粉孵育膜，再用自噬相关蛋白（p62、LC3 和beclin-1）和AMPK-mTOR-p70S6K 通路相关蛋白（AMPK、p-AMPK、mTOR、p -mTOR、p70S6K 和p -p70S6K）的一抗低温过夜孵育。次日，二抗室温孵育1h。最后，使用BioRad 成像系统对印迹进行成像。

1.7 统计学方法 应用GraphPad Prism 8.0 软件分析两组之间的差异，采用t-test 检验。所有数据以均数±标准差（）表示。P<0.05 时差异有统计学意义。每次实验至少重复3 次。

2 结果

2.1 miR-100 在脓毒症心肌细胞模型中表达下调qRT-PCR 结果表明，miR-100 在脓毒症心肌细胞模型中表达下调。同时，本研究为了研究miR-100 在脓毒症中的作用，在H9C2 细胞内转染miR-100 激动剂或miR-100 拮抗剂并用LPS 造模，使得脓毒症心肌细胞miR-100 过表达或表达下调（见表1）。

表1 miR-100 水平变化（）

表1 miR-100 水平变化（）

注：对照组为正常培养的心肌细胞H9C2；LPS 组为H9C2 用1μg/mL LPS 刺激24h；LPS+miR-100 激动剂组为在H9C2 细胞内转染miR-100 激动剂并用LPS 造模；LPS+miR-100 拮抗剂组为在H9C2 细胞内转染miR-100 拮抗剂并用LPS 造模；LPS 为脂多糖；与对照组比较，aP<0.05；与LPS 组比较，bP<0.05；与LPS+miR-100 激动剂组比较，cP<0.05

2.2 miR-100 对脓毒症心肌细胞的炎症因子水平的影响 ELISA 检测炎症因子水平，结果发现与对照组比较，LPS 组炎症因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平显著增加，脓毒症体外细胞模型构建成功。同时发现，与LPS 组比较，LPS+miR-100 激动剂组上调miR-100 表达，炎症因子分泌量降低；LPS+miR-100拮抗剂组敲低miR-100 水平可促进炎症因子分泌。见表2。

表2 miR-100 对IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平影响（pg/mL，）

表2 miR-100 对IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平影响（pg/mL，）

注：对照组为正常培养的心肌细胞H9C2；LPS 组为H9C2 用1μg/mL LPS 刺激24h；LPS+miR-100 激动剂组为在H9C2 细胞内转染miR-100 激动剂并用LPS 造模；LPS+miR-100 拮抗剂组为在H9C2 细胞内转染miR-100 拮抗剂并用LPS 造模；LPS 为脂多糖；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；IL-6 为白细胞介素-6；IL-1β 为白细胞介素-1β；与对照组比较，aP<0.05；与LPS 组比较，bP<0.05；与LPS+miR-100 激动剂组比较，cP<0.05

2.3 miR-100 对脓毒症心肌细胞自噬的影响 免疫荧光结果表明，与LPS 组比较，LPS+miR-100 激动剂组miR-100 过表达，细胞内LC3 表达明显增加；反之，敲低miR-100，LPS+miR-100 拮抗剂组LC3 表达降低（见图1）。Western blot 结果显示，在LPS+miR-100 激动剂组LC3-Ⅰ/Ⅱ、beclin-1 表达上调，而自噬负调控蛋白p62 表达降低；LPS+miR-100 拮抗剂组LC3-II 及beclin-1 蛋白表达降低，而p62 表达升高，见图2。

图1 细胞免疫荧光检测LC3 蛋白（×200）

图2 Western blot 检测自噬相关蛋白表达

2.4 miR-100 影响AMPK-mTOR-p70S6K 通路相关蛋白表达 Western blot 检测AMPK-mTOR-p70S6K信号通路相关蛋白表达。结果表明，与LPS 组比较，LPS+miR-100 激动剂组上调miR-100 的表达，使得p-AMPK 表达上调，p-mTOR 和p-p70S6K 表达下调；LPS+miR-100 拮抗剂组下调miR-100 的表达，引起了相反的变化，见图3。

图3 Western blot 检测AMPK-mTOR-p70S6K 信号通路相关蛋白

3 讨论

自噬是机体重要的细胞代谢通路，一些受损细胞器及折叠错误的蛋白通过自噬途径降解后被细胞循环利用[8]。目前认为，自噬在多种疾病中发挥重要的调节作用[9]。研究表明，自噬在多种炎症、免疫相关性疾病中发挥抗炎作用，包括炎症性肠病、心肌梗死、动脉粥样硬化、脑梗死等[10-14]。在脓毒症中，已有报道指出，上调自噬水平，尤其是巨噬细胞等炎症免疫细胞，可以降低脓毒症动物模型的死亡率，发挥心脏等多器官保护作用[15]。另有报道指出，上调自噬水平可以通过抗炎作用减轻脓毒症引起的心肌损伤[16]。

已有研究表明，miR-100 在细胞中能够调节自噬，进而影响多种疾病发展，如结直肠癌、肾癌、肝细胞癌、慢性血管炎症等[7，17-19]。miR-100 在肾细胞癌中增强自噬并抑制了细胞迁移和侵袭[18]。并且，miR-100 能够通过抑制mTOR 和IGF-1R 表达增强肝癌细胞的自噬[19]。本研究利用LPS（1μg/mL）刺激大鼠心肌细胞H9C2，构建了脓毒症体外细胞模型。ELISA检测炎症因子水平，发现LPS 刺激后，炎症因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平显著增加，表明脓毒症体外细胞模型构建成功。LPS 处理心肌细胞H9C2后，qRT-PCR 发现miR-100 表达下调。然而，通过在脓毒症心肌细胞过表达miR-100，发现细胞自噬水平增强，同时炎症因子表达下调，促炎作用减弱，抗炎作用增强；反之，下调miR-100 表达，心肌细胞自噬水平减弱，炎症反应增强。本研究结果表明，LPS诱导H9C2 细胞使miR-100 表达下调，炎症反应增加；过表达miR-100 能够上调自噬，减弱炎症反应，考虑miR-100 是多因素多通路调控自噬中的一个环节，自噬作为保护性机制发挥抗脓毒症作用。

已知AMPK-mTOR-p70S6K 为经典的自噬相关信号通路[20]。同时，与此信号通路相关的自噬在多种炎症相关性疾病中发挥了抗炎作用[21-22]。Western blot发现，上调miR-100 的表达，使得通路中p-AMPK表达上调，进而导致p-mTOR 和p-p70S6K 表达下调；下调miR-100 的表达则引起相反的变化，进而引起相关自噬蛋白表达变化，影响细胞自噬。本研究发现，上调或下调miR-100 的表达能够引起AMPKmTOR-p70S6K 通路相关蛋白表达发生相应的变化，明确了过表达miR-100 可以通过上调AMPKmTOR-p70S6K 介导的自噬水平，进而在脓毒症中发挥保护作用。