基于网络药理学策略探讨四君子汤治疗癌性恶病质的潜在机制

陈江锋 林芝娴 郭 勇

癌性恶病质被国际共识小组定义为一种多因素综合征，其特征是骨骼肌质量持续下降（伴或不伴脂肪减少），不能通过常规营养支持完全逆转，导致进行性损害[1]。50%～80%的癌症患者最终会发展为恶病质，进一步加速了癌症患者的死亡。因此，癌性恶病质的治疗一直是恶性肿瘤综合治疗中的重要组成部分。四君子汤被广泛应用于治疗癌性恶病质，其对疲劳、食欲不振、体重减轻等症状有较好的疗效[2-3]。研究发现，四君子汤可以显著降低血清中白细胞介素-1（interleukin 1，IL-1）、白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）的水平，减缓癌性恶病质骨骼肌萎缩的发生，改善癌性恶病质患者的营养状况，延缓疾病的进一步发展[4-6]。然而目前四君子汤对癌性恶病质的具体作用机制尚不清楚，鉴于中医治疗的整体观念和中药方剂多化合物、多靶点、多通路协同作用的特点，本研究采用四个连续模块（靶点预测、网络构建、分子对接、GO 和KEGG 富集分析）组成的综合网络药理学方法探讨四君子汤治疗癌性恶病质的潜在机制。

1 方 法

1.1 靶点预测

1.1.1 四君子汤的化合物 查询中药系统药理学数据库（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和中医药综合数据库（TCMID，http://bidd.group/group2017/index.html），参照TCMSP 数据库中常用的标准：口服生物利用度（OB）≥30%，药物相似性（DL）≥0.18，Caco-2≥0，通过Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索每个活性化合物的化学结构，剔除没有结构信息的化合物。最终共搜索到105 个活性化合物。

1.1.2 四君子汤的复合靶点 Pharmmapper server（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）是一个持续更新的综合药效基因匹配平台。将105 种化合物的mol2 格式文件上传至Pharmmapper server，generate confomers 设置为No，maximum generated conformations 设置为300。在高级选项中，选择Druggable Pharmacophore Models（v2017，16159）作为靶点集，其他选项设置为默认，获得预测的靶点。将搜索到的靶点导入UniProt 数据库（http://stitch.embl.de），选择的物种为Homo sapiens，去除重复、非人、非标靶，通过检索和转化，最终得到四君子汤中活性化合物的450 个靶基因。

1.1.3 癌性恶病质的靶点 通过DrugBank database（https://www.drugbank.ca），Online Mendelian Inheritance in Man database（OMIM，https://omim.org），Human gene database（GeneCards，https://www.genecards.org）和Therapeutic Target Database（TTD，https://db.idrblab.org/ttd/）搜集癌性恶病质的相关靶点。以“Cancer cachexia”为关键词进行搜索，删除重复靶点，最终搜集到1189 个靶点。

1.1.4 蛋白相互作用网络构建 用Venny 2.1 软件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）将四君子汤的活性化合物靶点与癌性恶病质相关靶点进行匹配，选择重叠靶点作为四君子汤治疗癌性恶病质的靶点，使用String（https://string-db.org/）对相关靶点进行处理，蛋白类型设置为Homo sapiens，minimum required interaction score 设置为“medium confidence”（>0.4），其他参数设置为默认，获得最终的蛋白相互作用网络。

1.2 网络构建

1.2.1 网络构建的方法 Cytoscape 是一个开放性平台，用于可视化复杂网络并能将其与任何属性的数据进行处理。将化合物和蛋白相互作用网络的数据输入到Cytoscape 中，并构建不同的网络:复合靶点网络和化合物-靶点网络。

1.2.2 拓扑分析 通过拓扑参数分析，对复合靶点网络进行分析筛选。通过度中心性（degree centrality，DC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、介度中心性（betweeness centrality，BC）三个参数对重要靶点进行评价。这三个参数的大小代表了网络中节点的重要性。重要节点表示网络中输出值高。筛选标准为DC、CC、BC 大于1 倍中位数。最后，筛选出重要靶点。

1.3 分子对接 通过分子对接验证四君子汤中化合物与重要靶点的结合活性，筛选出潜在的活性成分。我们之前搜集到的105 个化合物的小分子结构都是从Pubchem 数据库中获取的，并保存为mol2 格式文件。所有具有重要靶点蛋白晶体结构的蛋白配体均从RCSB 蛋白数据库（https://www.rcsb.org/）中获得。SystemsDock（http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）是一个基于网络药物学预测和分析的网络服务器，使用高精度的对接模拟和分子通路图来充分表达配体的选择性，揭示配体在复杂分子网络中的作用。因此，我们将这两种数据导入SystemsDock 中进行分子对接，并以对接得分作为评价标准。

1.4 GO 和KEGG 富集分析 将用于治疗癌性恶病质的四君子汤的相关靶点导入到DAVID 数据库中（DAVID，http://david.abcc.ncifcrf.gov/）。所有的靶基因都被导入到基因列表中，物种被定义为人类。通过上述数据库检索和转换，进行GO 生物过程和KEGG代谢通路富集分析。P<0.05 为显著的生物过程。使用在线作图网站Omishare Tools（http://www.omicshare.com/tools/index.php/）将结果可视化。

2 结果

2.1 靶点预测 经过筛选和删除，在TCMSP 和TCMID 数据库中搜集到105 个四君子汤的化合物。其中党参16 个，白术2 个，茯苓13 个，甘草74 个。通过Pharmmapper server 对105 个化合物的靶点进行搜索，经UniProt 数据库处理后得到450 个潜在化合物靶点。通过检索DrugBank、OMIM、GeneCards 和TTD 数据库，共获得1189 个癌性恶病质的相关靶点。最后，通过Venny 2.1 软件获得药物化合物与疾病的52 个交集靶点（见图1）。

图1 四君子汤作用靶点和疾病靶点的Venny 图

2.2 网络构建 将蛋白相互作用网络的数据导入Cytoscape 软件，以确定靶蛋白之间的相互作用网络。图中的节点表示靶蛋白，边表示靶蛋白之间的相关性。剔除相关性较低的节点，包括50 个节点和140条边。拓扑分析的主要参数为度、接近中心性和介度中心性。初次筛选度为3.5，介度中心性为0.007233，接近中心性为0.404986，得到17 个节点、54 条边。第二次筛选度是6，介度中心性为0.030593，接近中心性为0.445491，最后得到了8 个节点和25 条边（见图2）。在蛋白相互作用网络中，根据度的大小，INS（25），ALB（25），VEGFA（16），CCND1（15），CTNNB1（14），CYCS（13），AR（12）和ACTA1（8）被认为是重要的靶点（见图3）。以这8 个重要靶点为基础，构建化合物-重要靶点网络（见图4），这个网络包括96 种化合物，其中ZINC00519174（PubChem CID：928837）、Gancaonin H（PubChem CID：5481949）、Frutinone A（PubChem CID：441965）和DFV（Pub－Chem CID：114829）与5 个重要靶点均相关。

图2 蛋白相互作用网络的拓扑筛选

图3 四君子汤治疗癌性恶病质的潜在靶点相互作用网络

图4 化合物-重要靶点网络

2.3 分子对接

2.3.1 结合活性验证 选取8 个重要靶点（INS、ALB、VEGFA、CCND1、CTNNB1、CYCS、AR 和 ACTA1），导入SystemsDock，与105 个四君子汤的化合物进行对接分析。超过7.0 分的化合物有168 个（20%），5.0～7.0 分的化合物有502 个（59.8%），4.25～5.0 分的化合物有68 个（8.1%）。共有102 种化合物（12.1%）的对接分数小于4.25。对接分数大于7.0 说明该化合物对靶点具有较强的结合活性，大于5.0 说明该化合物对靶点具有较好的结合活性，大于4.25说明该化合物对靶点具有一定的结合活性。因此，四君子汤的活性化合物与8 个重要靶点具有良好的结合活性。

2.3.2 核心化合物的筛选 对接结果表明，与8 个靶点对接得分最高的化合物为ergosterol peroxide（PubChem CID：5351516，和CYCS），glyasperin B（PubChem CID：480784，和VEGFA），dehydroeburicoic acid（PubChem CID：15250826，和 ALB），glyasperin F（PubChem CID：392442，和INS），ergosterol peroxide（PubChem CID：5351516，和AR），taraxerol（PubChem CID：92097，和ACTA1），7，9（11）-dehydropachymic acid（PubChem CID：15226717，和CCND1）和 5' -prenylbutein（PubChem CID：11267805，和CTNNB1）。使用PyMOL 软件对这8 对靶点化合物进行优化，对接的特异性蛋白配体相互作用如图5 所示。8 个靶点得分均在6 分以上的化合物为7，9（11）-dehydropachymic acid（PubChem CID：15226717），taraxerol（PubChem CID：92097），Cerevisterol（PubChem CID：10181133），hederagenin（Pub-Chem CID：73299），polyporenic acid C（PubChem CID：9805290），16 alpha-hydroxydehydrotrametenolic acid（PubChem CID：10743008），pachymic acid（Pub-Chem CID：5484385）和poricoic acid C（PubChem CID：56668247）。满足上述两个条件的化合物[7，9（11）-dehydropachymic acid 和taraxerol]被认为是可能通过作用于重要靶点而影响癌性恶病质的核心化合物。

图5 蛋白质-配体的对接模拟

2.4 GO 和KEGG 富集分析

2.4.1 GO 富集分析 用DAVID 工具对四君子汤治疗癌性恶病质的52 个靶点进行GO 富集分析，进一步明确交集靶点的可能作用。生物过程（biological process）、分子功能（molecular function）和细胞组分（cellular component）的比对条目见图6。

图6 四君子汤治疗癌性恶病质潜在靶点的生物学功能分析

2.4.2 KEGG 通路富集分析 通过KEGG 通路富集分析筛选出四君子汤对癌性恶病质中36 条生物通路有显著影响（见表1）。其作用机制主要涉及pathways in cancer，HTLV-I infection，viral carcinogenesis，human cytomegalovirus infection，PI3K-Akt signaling pathway，human papillomavirus infection 和thyroid hormone synthesis 等（见图7）。对36 条信号通路进行分析和整合，绘制出最终的通路图（见图8）。

表1 四君子汤靶点的通路分析

图7 四君子汤治疗癌性恶病质的KEGG 富集关键靶点气泡图

图8 四君子汤治疗癌性恶病质的潜在机制

3 讨论

在临床实践中，四君子汤对癌性恶病质的治疗有显著作用，可以减轻化疗引起的毒性或肌肉萎缩[5，7-9]。本文从网络药理学的角度探讨了四君子汤治疗癌性恶病质的潜在机制。

3.1 调节代谢 恶性肿瘤可通过自身代谢产生的有毒物质或通过改变机体代谢而引起恶病质，主要表现为葡萄糖代谢，脂质代谢和蛋白质代谢三个方面的异常。四君子汤通过其化合物如glycitein（Pub－Chem CID：5317750），isorhamnetin（PubChem CID：5281654），quercetin（PubChem CID：5280343），11-hydroxyrankinidine（PubChem CID：5318332）和AC1LCTJ1（PubChem CID：637112），可刺激INS 与其受体结合，调控PI3K-Akt 信号通路，上调Akt2 的表达，影响下游靶点，抑制PCK2 的表达，最终抑制胰岛素抵抗[10-11]，调节糖代谢，抑制癌性恶病质的发展。在四君子汤中，影响FABP3 的活性成分包括5 alpha-stigmastan-3，6-dione（PubChem CID：13992092），Ergosta -7，22 e -dien -3beta -ol（PubChem CID：5283628），poricoic acid C（PubChem CID：56668247），glyasperin C（PubChem CID：480859），gancaonin A（PubChem CID：5317478），和licocoumarone（Pub－Chem CID：503731），这些活性成分通过影响FABP3来调控PPAR 信号通路，进而下调下游靶基因转录表达水平，抑制脂质分解和脂肪酸氧化，从而降低机体能量消耗[12]。此外，四君子汤中的Taraxerol（Pub－Chem CID：92097）、perlolyrine（PubChem CID：160179）、Stigmasterol（PubChem CID：5280794）等成分可能通过调控mTOR 下游信号通路磷酸化4EBP1，增加eIF4E 和eIF4G 的结合活性，最终促进骨骼肌蛋白合成[13]。化合物如11-hydroxyrankinidine（PubChem CID：5318332）和AC1LCTJ1（PubChem CID：637112）作用于INS，Quercetin 作用于SKP1，进一步调控PI3K/Akt/mTOR 通路[14]，从而抑制蛋白分解。

3.2 抑制肿瘤 恶性肿瘤可通过促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤血管生成等途径导致癌性恶病质的发生发展。四君子汤的活性成分licochalcone B（PubChem CID：5318999）、isorhamnetin（PubChem CID：5281654）、calycosin（PubChem CID：5280448）等可能通过影响Wnt 和JAK-STAT 信号通路，抑制CCND1、CTNNB1、STAT5A 的表达[15-17]，调控细胞周期，抑制细胞增殖，发挥其抗肿瘤作用。7，9（11）-dehydropachymic acid（PubChem CID：15226717）、poriferasta-7，22 e-dien-3beta-ol（Pub-Chem CID：5283663）、luteolin（PubChem CID：5280445）等活性成分可能作用于IL6ST 和AR[18-19]，调节信号转导，最终抑制肿瘤细胞增殖。在四君子汤中，licochalcone B（PubChem CID：5318999）作 用 于STAT5A 和CYCS[20-22]，抑制JAK-STAT 等信号通路下游表达，促进肿瘤细胞凋亡。licochalcone B（Pub－Chem CID：5318999）对STAT5A 和CYCS 的调控可能是四君子汤对肿瘤细胞凋亡调控的关键部分。此外，四君子汤可能通过calycosin（PubChem CID：5280448）作用于VEGFA，调控PI3K-Akt、HIF-1、VEGF 信号通路下游基因的表达，最终抑制肿瘤血管生成[23-24]。

4 结论

运用网络药理学和分子对接方法预测四君子汤治疗癌性恶病质的化合物、靶点和通路。其潜在机制可能主要集中在调节代谢和抑制肿瘤两个方面，调节代谢包括调节葡萄糖、脂质和蛋白质的代谢，抑制肿瘤包括防止细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，抑制血管生成。特异性信号通路分析表明，四君子汤主要通过PI3K-Akt 和Wnt 信号通路发挥治疗癌性恶病质的作用。因此，四君子汤通过多个化合物、多个靶点、多个通路的直接或间接协同作用，能够有效地对抗癌性恶病质。然而，本研究仅是基于数据分析，尚需要进一步的体内和体外实验来验证。