夏枯草颗粒对乳腺增生模型大鼠增生乳腺组织Bcl-2、Bax、PCNA 蛋白表达的影响

姚玲莉 王金秋 叶 丹 盛贤能 郭 宇

乳腺增生症是女性常见的乳房疾病，发病率约为79.5%[1]。其本质是雌孕激素比例失调下的腺体增生与复旧不良。目前以药物治疗为主，如三苯氧胺、小金丸、乳癖消等。有研究发现，夏枯草颗粒对治疗乳腺增生症具有积极意义[2]。在超声提示下，夏枯草颗粒可有效减小增生乳腺组织的肿块直径、导管直径和腺体厚度[3]，达到较好的治疗效果。但由于缺少夏枯草颗粒作用于乳腺增生组织的理论依据，未能广泛应用于乳腺增生的治疗。动物实验研究提示，雌激素过度刺激背景下，乳腺组织增生与增殖细胞核抗原（PCNA）和B 细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）高表达相关[4-5]。本研究探讨夏枯草颗粒在乳腺增生组织中的作用及作用机制，报道如下。

1 实验材料

1.1 动 物 育龄期雌性SD 大鼠30 只，体质量180～220g，购自浙江维通利华责任有限公司，动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0001。饲养于宁波大学动物实验中心，动物使用许可证号：SYNK（浙）2019-0005。环境温度20～25℃，相对湿度40%～60%，12h循环灯光，分笼饲养，自由进食饮水。本研究经伦理委员会审核，对动物处置方法符合相关伦理要求。

1.2 试 剂 苯甲酸雌二醇及黄体酮注射液购于购于吉林华牧有限公司（规格2mL：4mg，批号 200222；规格2mL：20mg，批号Z00302）；夏枯草颗粒购自山东仙河药业有限公司（批号00860E2）。兔源性Bcl-2、Bcl-2 相关x 蛋白（Bax）、PCNA 单克隆抗体（江苏亲科生物有限公司，批号1109905、44q6915、64y1542）。

2 实验方法

2.1 动物乳腺增生模型制备 30 只雌性育龄期SD大鼠，适应性喂养1 周后随机数字表法分为正常对照组5 只，乳腺增生模型组25 只。乳腺增生模型组贯序肌注苯甲酸雌二醇0.5mg/kg 25 天及黄体酮4mg/kg 5 天[6]。同时，正常对照组肌注同体积生理盐水连续30 天。

2.2 分组及给药 将乳腺增生模型大鼠按随机数字表法分为模型对照组、三苯氧胺组及夏枯草颗粒低、中、高剂量组，每组5 只。三苯氧胺组大鼠予三苯氧胺1.8mg/kg 溶液灌胃；夏枯草颗粒低、中、高剂量组大鼠分别予夏枯草颗粒0.5、1.0、3.0g/kg 溶液灌胃；正常对照组及模型对照组大鼠予同体积生理盐水灌胃，每天1 次，连续28 天。

2.3 取材与制作石蜡切片 末次给药1 周后，禁食24h，六组大鼠同时处死，并观察乳房形态，取相同部位乳房（第四对左侧乳房）组织，经乳头向基底部最大切面取材。以4%多聚甲醛固定24h 后将乳腺组织修剪为0.5cm×0.5cm×0.5cm，放入至石蜡包埋，石蜡块切片厚度4μm，制病理切片。使用苏木精-伊红（HE）染色法对石蜡切片进行染色，在光镜下观察乳腺组织病理变化。

2.4 卵白素-生物素-过氧化酶复合法（ABC 法）测定乳腺组织Bcl-2、Bax、PCNA 表达 将大鼠乳腺组织切片进行脱蜡补水，加热、抗原修复，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3 次，每次5min。3%H2O2去离子水孵育，阻断内源过氧化酶活性。加血清封闭，加入一抗4℃下孵化过夜，PBS 冲洗3 次；加二抗，室温孵育50min，PBS 冲洗3 次；滴加生物素化过氧化酶复合物，孵育30min，PBS 冲洗3 次。二氨基联苯胺（DAB）显色剂显色。流水冲洗、干燥、脱水、中性树脂封片，显微镜下观察、获取图像、分析。

2.5 结果判断（1）HE 染色：低倍镜下计数每个小叶内腺泡数量，求出平均值。高倍镜下观察乳腺组织，计数增生体平均腺泡数量以及扩增导管数量。（2）免疫组化阳性细胞强度分析：用赛维尔图像分析系统自动读取组织测量区域，并分析计算出测量区域内弱中强阳性细胞数（阴性无着色，计0 分；弱阳性淡黄色，计1 分；中阳性棕黄色，计2 分；强阳性棕褐色计3分），总细胞数，阳性的累积光密度，阳性像素面积，组织面积。将每张切片内阳性数量及其染色强度转化为相应的数值，计算组织化学评分（HS），数值越大说明综合阳性强度越强。

2.6 统计学方法 应用SPSS24.0 软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示。采用单因素方差分析，以LSD 法进行两两组间多重比较，应用Graphpad prism 8.0.2 制图。以P<0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠乳腺组织病理学变化 低倍镜下正常对照组平均小叶内腺泡数3～6 个，高倍镜下乳腺导管上皮细胞排列规则，管腔无扩张，腔内未见分泌物及脱落细胞。模型对照组中，小叶腺泡数量明显增加，多者达30 个，部分小叶被腺泡充满，管腔扩张，腔内充满分泌物并伴有少量脱落上皮细胞。导管上皮细胞增生且排列稍不规则，呈假复层或乳头状，同时核仁明显。提示乳腺增生造模成功。低倍镜下观察，三苯氧胺组纤维组织增生明显，小叶腺泡数5～10个，导管上皮细胞排列规则，未见明显增生，管腔扩张，腔内见少许分泌物及脱落上皮细胞；夏枯草低剂量组纤维组织稍增生，小叶腺泡数量较多8～15 个，导管上皮细胞排列规则，未见明显细胞增生，腔内见少许分泌物但未见明显脱落上皮细胞；夏枯草中、高剂量组，乳腺导管上皮细胞排列规则，未见明显细胞增生，部分接近正常对照组，部分仍可见管腔扩张，但管腔内分泌物较少，可见少量脱落上皮细胞。见图1。

图1 各组大鼠乳腺组织增生病理（HE ×400）

3.2 各组大鼠乳腺组织平均腺泡导管数及扩张导管数比较 与正常对照组比较，模型对照组大鼠乳腺组织平均腺泡导管数及扩张导管数明显增多（P 均<0.01）。与模型对照组比较，夏枯草低、中、高剂量组及三苯氧胺组大鼠乳腺组织腺泡导管数减少（P 均<0.05），并且三苯氧胺及高剂量组的平均腺泡导管数最接近正常对照组。见表1。

表1 各组大鼠乳腺组织平均腺泡导管数及扩张导管数比较（）

表1 各组大鼠乳腺组织平均腺泡导管数及扩张导管数比较（）

注：正常对照组未建立乳腺增生模型，予生理盐水灌胃4 周；模型对照组建立乳腺增生模型，予生理盐水灌胃4 周；三苯氧胺组建立乳腺增生模型，予三苯氧胺1.8mg/kg 灌胃4 周；夏枯草颗粒低、中、高剂量组，为建立乳腺增生模型后分别予夏枯草颗粒0.5、1.0、3.0g/kg 灌胃4周；与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05

3.3 各组大鼠乳腺组织Bcl-2 表达HS 评分比较Bcl-2 阳性染色多位于细胞核内，并有细胞胞浆染色，大多切片中蛋白表达为弥漫表达。Bcl-2 蛋白表达在各组染色为黄棕色或棕色颗粒，肉眼所见差异并不显著（见图2）。六组大鼠乳腺组织Bcl-2 表达HS 评分差异有统计学意义（F=2.431，P<0.05）。LSD法分析结果显示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠乳腺组织Bcl-2 表达差异无统计学意义（P=0.926）。与模型对照组比较，夏枯草高剂量组Bcl-2 表达明显降低（P<0.05），夏枯草低、中剂量组及三苯氧胺组Bcl-2 表达呈降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

图2 各组大鼠乳腺组织Bcl-2 表达免疫组化图（ABC 法×400）

3.4 各组大鼠乳腺组织Bax 表达HS 评分比较 Bax阳性染色主要为细胞胞浆染色，模型对照组大鼠乳腺组织Bax 蛋白表达染色为浅黄色，在三苯氧胺组以及夏枯草干预各组染色为棕黄色（见图3），肉眼未见明显差异。六组大鼠乳腺组织Bax 免疫组化HS 评分差异有统计学意义（F=3.125，P<0.05）。与正常对照组比较，模型对照组大鼠乳腺组织Bax 表达降低（P<0.05）。与模型对照组比较，三苯氧胺组及夏枯草低、中、高剂量组大鼠乳腺组织Bax 呈降低趋势，但各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

图3 各组大鼠乳腺组织Bax 表达免疫组化图（ABC 法×400）

3.5 各组大鼠乳腺组织PCNA 表达HS 评分比较PCNA 阳性染色主要位于细胞核，并有胞浆染色。PCNA 蛋白表达在模型对照组中为深棕色颗粒，正常对照组及夏枯草低剂量组染色稍浅，在三苯氧胺组、夏枯草中、高剂量组PCNA 蛋白仅为淡黄色（见图4）。六组大鼠乳腺组织PNCA 蛋白免疫组化HS 评分统计分析结果显示，差异有统计学意义（P<0.01）。与正常对照组比较，模型对照组大鼠乳腺组织PCNA表达水平显著升高（P<0.05）。与模型对照组比较，三苯氧胺组及夏枯草低、中、高剂量组大鼠乳腺组织PCNA 表达明显降低（P 均<0.05），且接近正常对照组。见表2。

图4 各组大鼠乳腺组织PCNA 表达免疫组化图（ABC 法×400）

表2 各组大鼠乳腺组织Bcl-2、Bax、PCNA 表达HS 评分比较（分，）

表2 各组大鼠乳腺组织Bcl-2、Bax、PCNA 表达HS 评分比较（分，）

注：正常对照组未建立乳腺增生模型，予生理盐水灌胃4 周；模型对照组建立乳腺增生模型，予生理盐水灌胃4 周；三苯氧胺组建立乳腺增生模型，予三苯氧胺1.8mg/kg 灌胃4 周；夏枯草颗粒低、中、高剂量组，为建立乳腺增生模型后分别予夏枯草颗粒0.5、1.0、3.0g/kg 灌胃4周；Bcl-2 为B 细胞淋巴瘤-2；Bax 为B 细胞淋巴瘤-2 相关X 蛋白；PCNA 为增殖细胞核抗原；HS 为组织化学评分；与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05

4 讨论

乳腺增生症在病理学上表现为乳腺腺泡和导管局灶性增生，并伴有间质纤维组织进行性增生，小叶失去正常形态，分为一般性增生和非典型增生[7]。PCNA 与Bcl-2 蛋白高表达被认为与乳腺腺体增生有关。PCNA 作为修复与DNA 复制的组成部分，参与细胞S 周期控制、细胞凋亡[8]。在单纯性增生中可见PCNA 阳性细胞，增殖指数和PCNA 的阳性程度与非典型上皮增生的增殖程度呈正相关[9]。Bcl-2 与Bax 为Bcl-2 基因家族成员，两者共同调控细胞凋亡。在细胞中Bcl-2 同源性区域3（BH3）蛋白通过抑制线粒体和内质网中的抗凋亡蛋白传播细胞凋亡信号，或直接刺激Bax 等促凋亡蛋白表达，导致Bax 寡聚导致线粒体外膜透化，最终诱导细胞凋亡，Bcl-2则可与BH3 基序结合隔离促凋亡蛋白Bax，抑制凋亡[10]。当Bcl-2 过表达，促凋亡与抗凋亡蛋白平衡被打破，则使细胞存活增殖。

夏枯草颗粒具有免疫调节[11]、抗炎[12]、抗肿瘤[13]等多种药理作用。本研究结果显示，与模型对照组比较，使用夏枯草药物干预组，乳腺平均腺泡导管数与扩张导管数明显减少，更接近正常乳腺组织结构。

本研究还显示，模型对照组中大鼠乳腺导管上皮细胞中PCNA 表达明显增高，采用夏枯草颗粒治疗组后，PCNA 表达则明显下降。提示PCNA 与乳腺增生相关，夏枯草颗粒通过抑制PCNA 表达发挥作用。近年研究提出，抑制PCNA 的酪氨酸211 磷酸化则可减少PCNA 表达，实现抑制细胞增殖的结果[14]，但是否为夏枯草抑制PCNA 的机制，仍需进一步研究。正常对照组乳腺组织中Bax 表达明显高于模型对照组，这一结果提示，Bax/Bcl-2 极有可能参与乳腺增生，在增生乳腺组织中Bcl-2 过表达抑制Bax表达。在熊燚等[15]的研究，夏枯草发挥抗甲状腺肿瘤的作用与Bax/Bcl-2 蛋白表达有关，夏枯草处理组Bcl-2 蛋白表达水平减少（P<0.05）；凋亡蛋白Bax 表达有增加趋势，但差异无统计学意义。本研究发现，高剂量组与模型对照组比较，Bcl-2 明显减少（P＜0.05），与以往此类研究基本相一致。

综上所述，夏枯草颗粒可通过降低PCNA 表达，下调Bcl-2 及促进Bax 表达来改善大鼠乳腺增生。