硫代艾地那非薄层色谱-表面增强拉曼光谱定性研究

刘桂花，刘福堂，孙晶，张中湖

(1.山东阿卡迪亚药业有限公司，山东 济南 250101；2.山东京卫制药有限公司，山东 泰安 271000；3.山东省食品药品检验研究院，山东省食品药品安全检测工程技术研究中心，山东 济南 250101)

非法添加问题是个国际性难题，食品、中成药、保健食品、化妆品[1-4]都有非法添加现象，常见检测方法包括薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)、高效毛细管电泳(HPCE)、胶体金试剂盒法[5-10]等。薄层色谱-表面增强拉曼光谱(TLC-SERS)技术[11-13]，是将薄层分离功能与拉曼检测功能相结合，并基于谱库检索功能的一项实用性技术，与上述方法相比，具有定性准确优点。本试验以硫代艾地那非为目标检验物，测试TLC-SERS的定性检测能力，为非法添加的快速筛查提供新的技术支持。

1 试验材料

1.1 仪器与系统 薄曼联用仪，型号：KH4500薄层色谱扫描仪-R10拉曼光谱仪，联用；TRAFIC系统，一种基于拉曼光谱的药品快检软件，软著登字第3925804号。

1.2 试剂与样品 硫代艾地那非对照品(批号：520048-201401，中国食品药品检定院)；氯仿(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙酸乙酯(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；甲醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；硝酸银(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；柠檬酸三钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；水。

2 试验方法

2.1 对照品溶液的制备 称取硫代艾地那非对照品适量，加甲醇溶解，制成1.0 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。

2.2 水相银溶胶的制备 称取90 mg的硝酸银于500 mL去离子水中加热至沸腾，逐渐加入1%的柠檬酸三钠溶液10 mL，同时剧烈搅拌，保持沸腾1 h，继续搅拌至溶液冷却，得到灰绿色的银溶液。

2.3 样品制备、点样、展开、成像、点胶、图谱采集、数据上传和处理，形成报告。

薄曼联用仪预热，放置待测溶液、薄层板到相应位置；工作站录入样品信息后，设置点样参数(见图1)，自动点样。取出薄层板，于氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(40∶40∶15∶12)中展开，展距约8.0 cm，取出晾干，放回薄曼联用仪； 254 nm成像确定点胶位置，设置点胶参数，自动点胶；点胶后每个斑点扫描1次，上传至TRAFIC系统，与SERS标准库遍历比对，下载筛查报告。

图1 薄曼联用仪点样设置界面

2.4 采集参数考察

2.4.1 点样量考察 固定采集参数：点胶量：2 μL；积分时间：3 s；激光功率：100%；平均次数：1次，分别吸取对照品溶液1、2 μL，各点样3次，于展开剂中展开后，于254 nm紫外灯下成像后考察不同点样量对薄层色谱图的影响。

2.4.2 点胶量 固定采集参数：点样量：1 μL；积分时间：3 s；激光功率：100%；平均次数：1次，分别吸取水相银溶胶1、2、3、4 μL进行试验，考察点胶量对SERS光谱图的影响。

2.4.3 积分时间 固定采集参数：点样量：1 μL；点胶量：2 μL；积分时间：3 s；激光功率：100%；平均次数：1次，分别在积分时间1、2、3、4、5 s进行试验，考察积分时间对SERS光谱图的影响。

2.4.4 激光功率 固定采集参数：点样量：1 μL；点胶量：2 μL；积分时间：3 s；平均次数：1次；分别在激光功率20、40、60、80、90、100进行试验，考察激光功率对SERS光谱图的影响。

2.4.5 平均次数 固定采集参数：点样量：1 μL；点胶量：2 μL；积分时间：3 s；激光功率：100%；平均次数：分别在平均次数1～5进行试验，考察平均次数对SERS光谱图的影响。

2.5 检出限考察 分别配置不同浓度(0.1、0.2、0.5、1 mg·mL-1)的硫代艾地那非的标准溶液，每个浓度的样品各点样6次，按检测的最佳光谱条件设置参数，以样品斑点展开、成像后，根据样品斑点在254 nm下显像及样品的SERS谱图与标准库中标准SERS谱图(见图2)的特征峰匹配度大于0.833判断本品的检出限。

图2 硫代艾地那非SERS建库谱图

2.6 精密度考察 取1 mg·mL-1的对照品溶液，同一薄层板上点样6次、展开、显色、点胶后采集拉曼光谱上传，计算各样品的SERS谱图与标准SERS谱图的相似度、匹配度值。

2.7 水相银溶胶对SERS影响考察 按“2.2”项下方法自制3个批次的水相银溶胶(批号：20190410-1、20190410-2、20190412-1)，取约1 mg·mL-1的对照品溶液，每个批次的水相银溶胶测定6个斑点。

3 试验结果

3.1 样品采集参数的确定

3.1.1 点样量的考察结果 由图3可知，当点样量为1 μL时，斑点呈窄细的条带状，而2 μL时，则出现样品过载的现象，斑点较大，不易于斑点的定位，故将点样量确定为1 μL。

图3 不同点样量的薄层展开图(1～3点样量为2 μL；4～6点样量为1 μL)

3.1.2 点胶量的确定 由图4可知，当点胶量为2 μL时，样品SERS谱响应最高，再增大点胶量，不仅不能有效地提高样品SERS谱响应，反而提高样品SERS谱的基线，故将点胶量设置为2 μL。

图4 不同点胶量的拉曼检测结果

3.1.3 积分时间的确定 由图5可知，当积分时间为3 s时，样品SERS谱响应最好，再增大积分时间，样品SERS谱的峰高增加不明显，故将积分时间设置为3 s。

图5 不同积分时间的拉曼检测结果

3.1.4 激光功率的确定 由图6可知，样品SERS谱响应随激光功率的增加而增强，当激光功率为100%时，样品SERS谱响应最好，故将激光功率设置为100%。

图6 不同激光功率的拉曼检测结果

3.1.5 平均次数的确定 由图7可知，样品SERS谱响应随平均次数的增加而减弱，当平均次数为1次时，样品SERS谱响应最高，故将平均次数设置为1次。

图7 平均次数对拉曼检测结果的影响

3.2 检出限 在最佳采集参数、拉曼检测条件(点样量1 μL，点胶量2 μL，积分时间3 s，激光功率100%，平均次数1次)下，0.2 mg·mL-1硫代艾地那非对照品的样品斑点展开、成像后，清晰可见、易于定位，详见图8；同一样品溶液，连续点样6次，设定相似度值高于0.95以及特征峰匹配度高于0.7，为判定硫代艾地那非SERS谱的快检结果为掺杂的标准，故将检出限定为0.2 mg·mL-1，快检结果见表1，硫代艾地那非典型的快检报告见图9。

图8 0.2 mg·mL-1硫代艾地那非连续点样6次检出限薄层展开图

图9 硫代艾地那非典型的快检报告

表1 硫代艾地那非SERS谱检出限快检结果

3.3 重现性 点6个样展开重现性结果见图10，6个样SERS谱与标准库比对结果见表2。

图10 1 mg·mL-1硫代艾地那非连续点样6次重现性薄层展开图

表2 硫代艾地那非SERS谱重现性快检结果

相似度值的平均值0.97，RSD=0.28%，说明全谱相似度重现性良好；特征峰匹配从100%匹配到74%匹配，存在一定误差。全谱相似度与特征峰匹配度计算方式有差异，特征峰匹配度更多体现差异部分，因此在相似度良好的情况下，特征峰匹配度有较大差异。

3.4 不同批次水相银溶胶对硫代艾地那非SERS影响分析 3个批次水相银溶胶，增强1 mg·mL-1硫代艾地那非的SERS见图11，全谱轮廓基本一致，强度差异较大。3个批次水相银溶胶对硫代艾地那非SERS的快检结果，见表3，除20190410-1批次水相银溶胶6个斑点的快检结果均为掺杂外，其余两个批次水相银溶胶均有1个斑点的快检结果为疑似，其余5个斑点的快检结果均为掺杂。

图11 不同批次水相银溶胶作用下硫代艾地那非SERS对比图

表3 不同批次水相银溶胶对硫代艾地那非SERS的快检结果

4 结论

本试验以硫代艾地那非为研究对象，通过单因素影响试验确定了硫代艾地那非TLC-SERS的最佳采集参数和检测条件，在此基础上研究了硫代艾地那非的检测限、重现性及不同水相银溶胶对硫代艾地那非SERS的影响，为样品SERS检测条件的确定、方法学的初步考察提供了参考。

随着检测体系的升级改造，从联用仪优化为一体机，拉曼光谱仪成为薄层色谱扫描仪的检测器，该方法将从研究实验室走向市场，借助TRAFIC系统和互联网，为食品、中成药、保健食品、化妆品等的非法添加快速筛查，提供行之有效的TLC-SERS方法、仪器、标准支持。