张婷,梁国栋,刘卫东,肖云峰
(1.内蒙古大唐药业股份有限公司,内蒙古 呼和浩特 010010;2.内蒙古自治区蒙药新药研发企业重点实验室,内蒙古 呼和浩特 010010;3.内蒙古医科大学新药安全评价研究中心,内蒙古 呼和浩特 010010)
骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种全身代谢性骨病,表现为骨量减少、骨组织中微细结构被破坏,并伴有骨骼的易脆性、骨折的易患性增加的一种系统性退行性疾病,骨质疏松症以疼痛剧烈、背部弯曲、体型变矮、骨脆易折为临床症状,由于其发生概率高,危害严重,已经引起人们的高度重视[1]。蒙古民族过去是游牧民族,素有“马背上的民族”之誉称。由于生活习惯和生活方式的特点,其骨伤、骨折的发生率远远高于一般民族。并且其饮食习惯中,蒙古族居民长期大量饮用砖茶饮料食品,砖茶由粗老叶和茎加工而成,含氟量非常高,易造成氟骨症[2]。氟骨症主要表现为骨关节病,以骨硬化为主,并伴有骨质疏松和骨间膜改变,形成“地区性骨质疏松”[3]。目前,国内治疗此类骨质疏松一般是药物治疗。在药物疗法中,首选是雌激素替代疗法,虽然能减少绝经后妇女的骨丢失及骨折发生率,但同时也增加了患乳腺癌和子宫内膜癌的风险[4]。所以开发一类更加安全、有效、可靠的植物类药已非常迫切了。
骨质疏松属蒙医中“骨枯症”范畴[5],由于内蒙古独特的地理和气候环境孕育了种类繁多的中蒙药材资源,例如黄芪、甘草和蓝刺头等,都具有丰富的药理作用[6],在治疗骨质疏松方面具有副作用小等优点[7]。其中蓝刺头具有植物雌激素样作用,可通过雌激素样作用及促进骨形成,对骨吸收、骨形成偶联有一定调节作用,能降低骨转换率,以此达到防治骨质疏松的目的[8]。前期研究发现通过将黄芪、蓝刺头等有效部位进行不同配比后,其对大鼠骨质疏松症有一定的治疗作用[9-10]。因此开发出了一种高效低毒的蒙药复方新药甘蓝强骨片,用于治疗由氟骨症导致的骨质疏松。本实验通过摘除卵巢建立大鼠骨质疏松模型[11],考察甘蓝强骨片对大鼠骨质疏松模型的治疗效果。
1.1 实验动物与饲养环境 SPF级Wistar大鼠,内蒙古医科大学实验动物中心提供,实验动物生产许可证编号:SCXK(蒙)2015-0001。
饲养环境:屏障环境;温度:20~26 ℃,日温差≤3 ℃;相对湿度:41%~64%;换气次数:≥15次/h;照明时间:12 h/12 h明暗交替(150~300 Lux)。
1.2 药品与试剂 甘蓝强骨片(内蒙古盛唐国际蒙医药研究有限公司,批号:20200324);地塞米松磷酸钠注射液(湖北天药药业有限公司,批号:20190738);水合氯醛(天津市大茂化学试剂厂,批号:20181124);羧甲基纤维素钠(天津市致远化学试剂有限公司,批号:20190304)。
1.3 主要仪器设备 电子天平(北京塞多利斯仪器系统有限公司,型号:BS2202S);实体解剖显微镜(德国Leica公司,型号:DFC 290);双能X线骨密度仪(美国GE公司,型号:Dexa Pro-1);精密电子万能材料试验机(日本岛津公司,型号:AGS-J)。
1.1 骨质疏松模型的建立 Wister大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL·(100 g)-1,大鼠麻醉后,俯卧位固定定于手术台上,在腰背部备皮后,分别用酒精、碘酒对皮肤消毒,沿背部腰椎偏正中线向下切开皮肤2 cm左右,再切开肌肉大约1 cm,打开腹腔,用无菌镊将卵巢夹出,在子宫角上用3号手术线结扎输卵管,剪断输卵管,提起呈深粉桑葚状的卵巢,切除卵巢,缝合腹膜切口。用同样方法操作对侧,在切口处撒上青霉素钠冻干粉后缝合肌肉及皮肤切口,术后肌注2万单位(U)的青霉素钠。术后护理大鼠3 d,观察大鼠状态,并每天肌注2万单位(U)的青霉素钠。
1.2 动物分组与给药 选取状态好的50只Wister大鼠随机将其分为模型对照组、甘蓝强骨片0.45、0.90、1.80 g·kg-13个剂量组、雌二醇阳性对照组,另取10只正常大鼠为空白对照组。分组后甘蓝强骨片3个剂量组灌胃给予相应浓度的药物混悬液,20 mL·kg-1,每天1次,连续15 d。阳性对照组每只大鼠皮下注射雌二醇20 ng·d-1,空白和模型对照组灌胃等容积0.5%羧甲基纤维素钠。
1.3 指标采集及检测
1.3.1 血清生化指标检测 第15天给药后30 min,全部大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g。麻醉后,腹主动脉取血。室温静置4 h后,3 000 r·min-1离心30 min,分离血清,置-20 ℃冰箱保存。分别按试剂盒说明书上步骤测定血中无机钙、磷、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)含量。
1.3.2 骨密度测定 取大鼠腰椎和左后肢股骨,仔细剥离附着的肌肉、结缔组织,生理盐水冲洗后,用生理盐水润湿后的纱布包裹,置-20 ℃保存。测定骨密度时置于双能X线骨密度仪下扫描,测量股骨骨密度。
1.3.3 股骨的干重、灰重测定 左肢股骨测完密度后,置于烘箱105 ℃中烘烤1 h后,冷却、称量,记录各组大鼠股骨干重后,将各组标本置于电阻炉中6 h,在干燥器中冷却至室温后用电子分析天平测各组灰重。
1.3.4 骨生物力学检测 将大鼠右侧股骨置于万能力学试验机中,进行三点弯曲实验,跨距设置为14 mm,加载速度为2 mm·min-1,测定最大载荷(N)。
3.1 甘蓝强骨片对血清生化指标的影响 与模型对照组比较,甘蓝强骨片0.45、1.8 g·kg-1剂量组大鼠血钙水平明显升高(P<0.05);1.8 g·kg-1剂量组大鼠血磷水平显著升高,ALP水平显著降低(P<0.05),结果如表1所示。
表1 甘蓝强骨片对血清生化指标的影响
3.2 甘蓝强骨片对股骨密度的影响 与模型对照组比较,甘蓝强骨片0.45 g·kg-1剂量组大鼠股骨密度明显增大(P<0.05),0.9和1.8 g·kg-1剂量组大鼠股骨密度略有增高,结果如表2所示。
表2 甘蓝强骨片对股骨密度的影响
3.3 甘蓝强骨片对股骨干重和灰重的影响 与模型对照组比较,甘蓝强骨片0.9、1.8 g·kg-1剂量组大鼠股骨干重明显增加(P<0.05);甘蓝强骨片0.45、0.9、1.8 g·kg-1剂量组大鼠的股骨灰重均明显增加(P<0.05),结果如表3所示。
表3 甘蓝强骨片对股骨干重和灰重的影响
3.4 甘蓝强骨片对骨生物力学的影响 通过测定股骨最大载荷(N),考察甘蓝强骨片对骨生物力学的影响。与模型对照组比较,甘蓝强骨片0.45、0.9 g·kg-1剂量组大鼠股骨最大荷载量明显增强(P<0.05),1.8 g·kg-1剂量组最大荷载量差异性不具有显著性,结果如表4所示。
表4 甘蓝强骨片对骨生物力学检测的影响
由于骨质疏松是一种在老年女性中发病率最高的慢性骨代谢疾病,尤其是在绝经后,雌激素水平迅速降低导致骨量流失严重,更容易出现骨质疏松,因此我们选择去卵巢大鼠建立骨质疏松模型。而且由于骨质疏松病理机制复杂,因此需要从生化、骨量、骨生物力学多个方面系统地考察甘蓝强骨片的药效学作用,具体包括以下指标:首先,血液中钙、磷和ALP的含量可以反映骨形成,结果表明甘蓝强骨片1.80 g·kg-1剂量组大鼠血清中钙和磷含量改善最佳;其次,通过测量股骨密度、干重和灰重,可以说明骨量的变化程度,其中骨密度是测量是评价骨质疏松类药物疗效的必要手段,骨密度越大说明骨质量越好。实验结果显示甘蓝强骨片0.45 g·kg-1剂量组提高股骨密度效果最好,而0.90 g·kg-1剂量组对增加大鼠干重和灰重的效果最佳;最后,检测股骨的最大载荷可以反映骨强度,分析骨骼的结构力学和材料力学性质。实验数据显示甘蓝强骨片0.45、0.90 g·kg-1剂量组可以更好地增强股骨的最大载荷。
综上所述,甘蓝强骨片对去卵巢骨质疏松模型大鼠的药效作用,不同的检测指标均表明在该实验条件下甘蓝强骨片具有抗骨质疏松的作用,为药物的进一步开发研究提供数据支持。