蒌芍痉挛平颗粒的血清药物化学研究

严国鸿，蒋昆霞，朱美玲，王雅心，吴蕙，徐伟

(1.福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004；2.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；3.福建中医药大学生物医药研发中心，福建 福州 350122)

蒌芍痉挛平来源于福建中医药大学附属人民医院梁晖主任临床经验方，福建中医药大学附属人民医院院内制剂，方中包括瓜蒌、白芍、桂枝、川芎、地龙、华重楼、甘草7味药材，此方具有清热养阴，柔筋缓急，活血通络之效。

蒌芍痉挛平颗粒在临床显示其干预脑卒中后瘫痪肢体肌肉痉挛疗效确切，为了探索其发挥功效的药效物质基础，本研究采用血清药物化学方法[1-4]，并且近年来超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)越来越多的用于中药血清药物化学的分析[5-8]，通过高分辨质谱对入血成分进行准确鉴定，因此本研究通过将UPLC-Q-TOF-MS应用于蒌芍痉挛平颗粒灌胃给药大鼠后的含药血清的主要入血成分的鉴定分析，旨在揭示蒌芍痉挛平颗粒给药后真正吸收入血、发挥抗脑卒中与神经保护作用的药效物质基础。

1 实验材料

1.1 仪器 I-class plus超高压输液系统串联Zevo XS高分辨飞行时间质谱仪(UPLC-Q-TOF-MS，美国Waters公司)；CPA225D 十万分之一分析天平(Sartorius公司)；Milli-Q 超纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2 试药 甲醇、乙腈(质谱纯，德国默克公司)；甲酸(色谱纯，批号：F190210，阿拉丁试剂上海有限公司)；其余试剂均为分析纯。原儿茶酸(批号：110809-200604)、芍药苷(批号：110736-201842)、甘草苷(批号：111610-201908)、木犀草苷(批号：111720-201810)、肉桂酸(批号：110786-201503)、阿魏酸(批号：110773-201915)、甘草酸(批号：110731-202021)、重楼皂苷Ⅶ(批号：100081-201610)、重楼皂苷Ⅱ(批号：111591-201604)、重楼皂苷Ⅰ(批号：111590-201604)、没食子酸(批号：110831-201906)、绿原酸(批号：110753-201716)、香草酸(批号：110776-201503)、甘草次酸(批号：110723-201715)对照品均购于中国食品药品检定研究院；去苯甲酰基芍药苷(批号：BBP03785)购于云南西力生物技术股份有限公司；1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(批号：MUST-17060201)、儿茶素(批号：MUST-16081503)、氧化芍药苷(批号：MUST-14081710)、异甘草苷(批号：MUST-15031204)、甘草素(批号：MUST-12022207)购于成都曼思特生物科技有限公司；芍药内酯苷(批号：150516)购于北京赛百草科技有限公司；芹糖甘草苷(批号：HS2113)、芹糖异甘草苷(批号：HS1209)、异甘草素-4′-O-芹糖(1→2)葡萄糖苷(批号：HS2991)、柠檬酸(批号：HS7792)、原儿茶醛(批号：HS9009)、芒柄花苷(批号：HS4862)、甘草皂苷G2(批号：HL00101)、苯甲酰芍药内酯苷(批号：HS1841)、苯甲酰芍药苷(批号：HS3864)、4-羟基肉桂酸(批号：HS7400)购于宝鸡市辰光生物科技有限公司；蒌芍痉挛平颗粒(福建省第二人民医院院内制剂，颗粒剂)。

1.3 动物 健康SPF级雄性SD大鼠12只，10～12周龄，体质量(250±20)g，购自福建中医药大学实验动物中心，动物许可证号：SYXK(闽)2019-0007，适应性喂养1周，每天自由进食、饮水。

2 方法

2.1 蒌芍痉挛平灌胃液的制备 取蒌芍痉挛平颗粒100 g，加入50%乙醇1 L回流提取2次(提取时间1 h)，合并滤液浓缩制得0.9 g·mL-1的灌胃液(按照临床剂量折算成大鼠灌胃给药剂量每天3.3 g·kg-1)。

2.2 空白血清及含药血清样品的制备 雄性健康SPF级SD大鼠6只，按3.3 g·kg-1剂量灌胃蒌芍痉挛平灌胃液，连续灌胃7 d，早晚各一次，分别于第7天末次给药后15 min取材。异氟烷麻醉机麻醉后，腹主动脉取血，离心分离得含药血清，-80 ℃存放备用。另取6只大鼠，同样给药方案进行空白生理盐水灌胃，分离得空白血清，-80 ℃存放备用。

2.3 血清样品的处理方法 参考文献方法[9]：精密吸取蒌芍痉挛平含药血清2 mL至离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋震荡2 min，然后于高速离心机中以10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，于室温下N2吹干，残渣用500 μL 50%甲醇进行超声复溶后置于高速离心机中以10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，即为蒌芍痉挛平含药血清供试品。取空白血清2 mL，同法操作，制备空白血清供试品。

2.4 色谱、质谱条件 色谱条件：Waters CORTECS C18(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)，流动相乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱(0～0.5 min，87%A-13%B；0.5～4.5 min，80%A-20%B；4.5～6.5 min，68%A-32%B；6.5～9 min，10%A-90%B)，流速0.25 mL·min-1，柱温40 ℃，进样量2 μL。

质谱条件：电喷雾负离子模式，扫描方式：一级质谱和二级质谱扫描模式，毛细管电压2.5 kV，锥孔电压3.00 V，脱溶剂气流N2，流速800 L·h-1，脱溶剂温度500 ℃，锥孔气流N2，流速50 L·h-1，离子源温度150 ℃，Extractor 3.00 V，碰撞气体氩气。总离子流色谱图见图1。

图1 蒌芍痉挛平颗粒空白血清(A)和含药血清(B)总离子流色谱图

2.5 单味药的提取方法 分别取原料蒌芍痉挛平颗粒各味药，包括瓜蒌、白芍、桂枝、川芎、地龙、华重楼、甘草，按照蒌芍痉挛平颗粒处方量提取方法进行提取，浓缩至干，然后加入10 mL 50%乙醇超声复溶，得各单味药提取液，置于高速离心机中以10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，再用50%甲醇稀释100倍，过0.22 μm微孔滤膜，既得单味药供试液，供LC-MS定性成分归属使用。

2.6 入血成分鉴定方法 精密吸取含药血清和空白血清各2 μL，在“2.4”项下的色谱、质谱条件下进样分析，得到高分辨质谱的总离子流色谱图，通过比较分析含药血清色谱峰保留时间及一级质谱(分子离子峰)和二级质谱(二级子离子)信息，鉴定入血成分。具体鉴定方法：首先，根据高分辨质谱总离子流色谱峰所得到的精确质量数即获得各个色谱峰的分子离子峰信息(MS1)，然后在Masslynx 4.2软件中的Tools Elemental Composition软件在10 ppm的质量偏差范围内计算其精确分子式，对各个色谱峰进行初步鉴定。其次，选择MS1分子离子峰进行二级质谱碰撞诱导解离(CID)，获得化合物相应的二级子离子质谱的裂解(MS2)信息，从而获得各个色谱峰的一级质谱和二级质谱信息，进行结构推测，同时根据对照品及文献(蒌芍痉挛平各个药味的化学成分研究)进一步比对推测其结构。

3 结果

3.1 原形入血成分分析 通过对蒌芍痉挛平含药血清总离子流色谱峰的质谱信息采集和鉴定，结果鉴定蒌芍痉挛平颗粒入血成分共35个，其中31成分经对照品比对确认，鉴定结果见表1。

表1 蒌芍痉挛平颗粒主要化学成分鉴定结果

表1(续)

表1(续)

3.2 蒌芍痉挛平颗粒血清药物化学成分归属及其质谱裂解分析 对UPLC-Q-TOF-MS鉴定入血移行成分进行分类归属，共鉴定得到了4类入血成分，共计35个成分，其中酚酸类化合物10个、单萜类化合物6个、黄酮类化合物9个、皂苷类化合物9个，化学结构见图2。

图2 蒌芍痉挛平含药血清中鉴定的化学成分结构

3.2.1 酚酸类 该类成分结构中多含有羧酸基团，倾向给出质子，在负离子模式下灵敏度优于正离子模式，形成[M-H]-的分子离子峰，在质谱的二级裂解行为中多产生[M-H-CO2]-或者酯键裂解的二级子离子，以峰3为例，其分子离子峰为[M-H]-m/z169.114 9，经高分辨质谱计算其分子式为C7H6O5，与白芍中的没食子酸分子量一致，然后经CID二级裂解[M-H-CO2]-子离子峰m/z125.024 3，经与对照品比对发现其二级数据与对照品一致，因此推测峰3为没食子酸，其质谱裂解推测见图3A。采用同样的方法，经过对照品比对我们共鉴定确认酚酸类成分10个：瓜氨酸(1)、没食子酸(3)、原儿茶酸(4)、绿原酸(7)、原儿茶醛(8)、香草酸(9)、4-羟基肉桂酸(12)、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(16)、阿魏酸(17)、肉桂酸(25)，化学结构见图2a，这些酚酸类成分来源瓜蒌、白芍、川芎和桂枝。

3.2.2 单萜苷类 结构由单萜苷元与葡萄糖和/或苯甲酰基、对羟基苯甲酰基组成，主要来源于臣药白芍，负离子模式下，一级质谱的分子离子峰容易产生[M+HCOO]-，二级质谱多表现出分子离子峰失去CH2O、葡萄糖基(Glc)、苯甲酰基(Benzoyl)等基团的丢失。以峰10为例，TOF-MS给出的分子离子峰m/z525.162 5，软件计算分子式为C24H29O13，与芍药苷加甲酸的离子峰[M+HCOO]-一致，在二级质谱图中的碎片离子327[M+HCOO-HCOOH-C7H7O2-CH2O]-,121[M+HCOO-HCOOH-C16H22O9]-,449[M+HCOO-HCOOH-CH2O]-,431[M+HCOO-HCOOH-CH2O-H2O]-，与对照品和文献报道的芍药苷[14]二级质谱碎片离子相一致，确认峰10为芍药苷，质谱裂解过程见图3B。采用同样的方法，经过对照品比对我们共鉴定确认单萜苷类成分6个：去苯甲酰基芍药苷(2)、氧化芍药苷(5)、芍药内酯苷(10)、芍药苷(11)、苯甲酰芍药苷(26)、苯甲酰芍药内酯苷(27)，化学结构见图2b，单萜苷类成分主要来源于臣药白芍。

3.2.3 黄酮类 本次鉴定的黄酮包括黄酮苷、二氢黄酮、查尔酮和黄烷醇类，在一级质谱上，黄酮类成分分子离子峰主要是[M-H]-峰，二级质谱上多表现苷键裂解失去糖基产生[M-糖基]-的子离子峰和2-苯基色原酮结构发生RDA裂解，以甘草的主要黄酮类成分甘草苷鉴定为例，一级质谱得到分子峰m/z417.118 6，计算分子式为C21H22O9，二级质谱扫描发现其失去葡萄糖基(Glc)得到子离子m/z255，同时苷元母核结构经RDA1，3位裂解得135[A1,3]-，119[B1,3]-子离子峰，经与甘草苷对照品比对确认，其质谱裂解推测见图3C。采用类似的方法，经过对照品和文献比对，本研究中共鉴定黄酮成分9个：芹糖甘草苷(13)、甘草苷(14)、木犀草苷(15)、芹糖异甘草苷(18)、异甘草素-4′-O-芹糖(1→2)葡萄糖苷(19)、异甘草苷(20)、芒柄花苷(21)、甘草素(22)、3′-羟基-4′-甲氧基光甘草定(32)，化学结构见图2c。黄酮类成分主要来源于甘草和瓜蒌。

3.2.4 皂苷类 本次鉴定的含药血清的主要皂苷类成分主要来自甘草的三萜皂苷和重楼的甾体皂苷，其在质谱上容易形成[M-H]-或[M+HCOO]-的分子离子峰，在二级质谱上，甘草皂苷类成分主要表现为苷键断裂失去葡萄糖醛酸(glucuronic acid，GlcA)，形成苷元的二级子离子峰和葡萄糖醛酸离子峰，而重楼皂苷分子离子峰均为[M+HCOO]-峰，而二级子离子则表现逐步脱糖基形成的子离子，以重楼皂苷Ⅱ为例，其分子离子峰为m/z1 059.537 4[M+HCOO]-计算其分子式为C52H84O22，二级质谱扫描得到m/z1 013[M+HCOO-HCOOH]-,m/z867[M+HCOO-HCOOH-Rha]-,m/z721[M+HCOO-HCOOH-2Rha]-的子离子，并经与对照品比对和文献确认，质谱裂解过程见图3D，采用该方法共鉴定9个皂苷类成分：乌拉尔甘草皂苷C(23)、甘草皂苷H2(24)、甘草皂苷G2(28)、甘草酸(29)、甘草酸异构体(30)、重楼皂苷Ⅶ(31)、重楼皂苷Ⅱ(33)、重楼皂苷Ⅰ(34)、甘草次酸(35)，化学结构见图2d。

图3 没食子酸(A)、芍药苷(B)、甘草苷(C)、重楼皂苷Ⅱ(D)可能的质谱裂解途径

4 讨论

针对蒌芍痉挛平颗粒含药血清中化学成分复杂多样性，本研究对色谱条件进行了优化：通过比较不同厂家色谱柱(Waters CORTECS C18、Shimadzu Inetsil C18、Ultimate Welch C18和Phenomenex Luna C18)对蒌芍痉挛平血清样品的分离效果，最终选择Waters CORTECS C18色谱柱。流动相系统经过优化选择乙腈-0.1%甲酸水，质谱经过优化发现负离子模式优于正离子模式。因此，本研究选择负离子模式作为质谱检测条件。

蒌芍痉挛平颗粒由瓜蒌、桂枝、白芍、川芎、地龙、重楼七味药组成，临床上用于脑卒中及脑卒中肢体痉挛的康复治疗。本研究结果表明其入血原型成分有35种：首先，如单萜苷类，如芍药苷、芍药内酯苷等来源于复方臣药白芍，现代药理研究认为白芍单萜苷类具有良好的抗炎作用，如芍药苷通过PI3K/AKT/GSK-3β途径抑制炎症反应[14]，并且通过抑制T淋巴细胞IFN-γ的产生和NF-κB/IκBα信号通路降低炎症反应[15]，提示其可能对脑卒中后炎症具有改善作用；其次，黄酮类成分如芹糖甘草苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素等则来自甘草，药理研究表明甘草黄酮通过调节代谢紊乱、抑制ERK1/2-NF-κB通路、激活NRF2-Keap1通路和抑制线粒体凋亡途径来保护PC12细胞免受皮质酮诱导的神经毒性[16]，并且能减轻痛觉过敏和疼痛，提高神经功能指数和运动神经传导速度，对慢性缩窄诱导的神经损伤有明显的神经保护作用[17]；君药瓜蒌中黄酮类成分木犀草苷可以通过调节缺血/再灌注中自噬相关指标来抑制缺血性脑损伤，也具有神经保护作用[18]。第三，皂苷类成分如甘草酸、甘草次酸等来自甘草，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ等来自重楼，现代药理研究表明甘草酸可以通过抑制HMGB1表达和易位来衰减神经元损伤及下调炎性细胞因子的表达发挥在神经疾病中的作用[19]，重楼皂苷Ⅰ通过调节凋亡因子(caspase-3、Bax和Bcl-2)、炎症因子(TNF-α、IL-6、iNOS和IL-10)和氧化应激标志物(SOD、GSH、ROS和MDA)的表达，对神经损伤具有良好的保护作用[20]。第四，酚酸类成分如没食子酸、阿魏酸、绿原酸也是复方入血成分，分别来自方中的白芍、川芎和瓜蒌，现代药理研究表明没食子酸、阿魏酸、绿原酸成分均能有效抑制神经损伤，具有显著的改善神经损伤作用[21-23]。另外，君药瓜蒌主要成分瓜氨酸对人脑缺血损伤有治疗作用[24]。

综上，本研究采用液质联用-血清药物化学研究鉴定了蒌芍痉挛平的35个血中移行成分，在脑卒中发生后，由于血脑屏障的破环，这些入血成分均有可能入脑发挥其各自功效，提示该方入血的单萜苷类、黄酮类、酚酸类、皂苷类等成分可能是蒌芍痉挛平治疗脑卒中后肢体痉挛与神经保护的主要体内药效物质。