三七总皂苷肠溶微丸的含量测定及体外释放度考察

文 丽，刘华钢，罗 轶，赖 玲，陆仕华，秦艳娥（.广西壮族自治区食品药品检验所/国家药品监督管理局中药材质量监测与评价重点实验室，广西 南宁 500；.广西壮族自治区药品监督管理局，广西 南宁 5009；.广西医科大学，广西 南宁 500；.南宁市第一人民医院，广西 南宁 50000）

三七总皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）是五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen的主要有效活性成分，治疗心血管疾病效果较为显著，临床上有多种以PNS为主要成分的制剂用于治疗心血管疾病如冠心病、高血压病、心力衰竭等[1]。PNS肠溶微丸能够避开胃酸及酶对三七总皂苷的破坏，同时增加其在肠道的吸收，因PNS中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的含量最高，是质量控制中的主要指标成分[2-9]，故实验选择该3种皂苷为指标测定和评价对象，建立PNS肠溶微丸的含量测定方法，并对PNS肠溶微丸进行体外释放度考察[10-18]，为该制剂的质量控制奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂PNS（梧州制药集团股份有限公司，批号：101124）；PNS肠溶微丸（自制，批号：110601，110603，110605）；三七皂苷R1对照品（批号：110745-201619）、人参皂苷Rg1对照品（批号：110703-201731）、人参皂苷Rb1对照品（批号：110704-201625）（中国药品生物制品检定所，供含量测定用）；甲醇（批号：206409）、乙腈（批号：197164）（美国Fisher Scientific公司，色谱纯）；高纯水（自制）；Acryl-EZER丙烯酸树脂肠溶包衣剂（上海卡乐康包衣技术有限公司，批号：050323）；空白微丸（上海华高药用丸芯有限公司，批号：101201）。

1.2 仪器LC-20AD型UHPLC，配备SPD-20A型紫外检测器（日本岛津公司）；XB-C18色谱柱（美国日旭公司）；BP210S电子天平（德国赛多利斯公司）；DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；FE28台式酸度计（梅特勒-托利多集团）；BGB5-10C高效包衣机（瑞安市东方制药有限公司）；BJ-3智能崩解实验仪（天津市旭阳仪器设备有限公司）；标准筛（上海筛网厂）。

2 方法与结果

2.1 PNS肠溶微丸（胶囊型）的制备 取三七总皂苷90 g，羟丙基甲基纤维素4.5 g，低取代羟丙基纤维素4.5 g，混匀，用60%乙醇溶解，置恒流泵中，开启浆叶不断搅拌。将空白微丸置包衣机中滚动预热，喷浆液上药，至长大成丸。完成上药后再滚转25 min，喷丙烯酸树脂肠溶包衣剂进行包衣，至微丸增重20%，停止喷液，继续滚转25 min，取出，45℃下干燥6 h，将筛选出的微丸装入普通胶囊，即得。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取减压干燥至恒重的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1各20 mg，置于20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成贮备液。4℃冷藏保存。

2.2.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，混匀，研细，取0.19 g（约含PNS 20 mg），精密称定，至100 mL容量瓶中，加水80 mL，超声处理15 min，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.2.3 空白辅料溶液的配制 按处方组成，取除PNS以外的所有辅料，按制备工艺要求，制成不含PNS的微丸（胶囊型），按供试品溶液制备项下的方法，制成空白辅料溶液。

2.3 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱，流脱程度为：0 min～17 min，25%A；17～18 min，25%A→45%A；18～25 min，45%A→25%A；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：203 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。按上述色谱条件测定，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的分离度分别为5.95、4.73、12.09，分离效果良好。理论塔板数按三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰计算分别为10852.3、12536.3、18825.7。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和空白辅料溶液各20 μL，于上述色谱条件下进样，记录色谱图。结果供试品色谱峰与对照品色谱峰保留时间一致。空白辅料溶液在相应保留时间无色谱峰，表明空白辅料对主成分无干扰。（见图1）

图1 HPLC色谱图

2.4.2 线性关系考察 精密称取空白辅料6份，再分别精密量取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对照品贮备液适量，按“2.2.2”项下处理，获得一组标准工作液，精密吸取20 μL，注入超高效液相色谱仪，测定，即得。以浓度峰面积A为横坐标，以峰面积C为纵坐标进行线性回归，得到标准曲线方程、相关系数r和线性范围。结果三七皂苷R1：C=0.0002A-3.8741（r=0.9995），线性范围3.477～111.250 μg·mL-1，人参皂苷Rg1：C=0.0002A-1.6865（r=0.9999），线性范围4.517～114.985 μg·mL-1，人参皂苷Rb1：C=0.0002A-0.8396（r=0.9998），线性范围4.783～152.100 μg·mL-1，线性关系良好。

2.4.3 精密度试验 取同一浓度的PNS供试品，重复进样6次，测得峰面积值。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的RSD分别为0.53%、1.08%、1.37%。表明该方法精密度良好。

2.4.4 检测限与定量限 检测限和定量限由信噪比法确定，在上述色谱条件下，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的检测限分别为0.584、0.631、0.565 μg·mL-1，定量限分别为1.752、1.893、1.695 μg·mL-1。

2.4.5 稳定性试验 取PNS肠溶微丸，按“2.2.2”项下处理，供试品溶液于室温下放置，分别于0、4、8、12、24、48 h测定，考察室温条件下3种皂苷的稳定性。结果显示：三七皂苷R1在0、4、8、12、24、48 h含量分别为18.68、18.66、18.59、18.57、18.51、18.42 μg·mL-1，RSD为0.52%；人参皂苷Rg1在0、4、8、12、24、48 h含量分别为117.48、117.27、117.09、116.56、116.08、115.34 μg·mL-1，RSD为0.67%；人参皂苷Rb1在0、4、8、12、24、48h含量分别为67.11、67.03、66.77、66.48、66.04、65.48 μg·mL-1，RSD为0.99%。表明供试品溶液在室温放置48 h，其3种皂苷稳定性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取已知含量的供试品9份，每份约20 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，精密量取“2.2.2“项下的对照品贮备液，分别加入高、中、低（1.2、1.0、0.8）浓度的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品溶液，每个浓度分别按“2.2.2”项下方法制备3个供试品溶液，测定各组分含量，计算加样回收率。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1平均回收率率分别为101.61%、100.89%、100.23%、RSD分别为1.82%、2.36%、1.45%。表明此测定方法准确度较好。（见表1）

表1 加样回收率试验结果（n=9）

续表1：

2.4.7 样品含量测定 分别称取3批肠溶微丸10 g，研细，精密称取粉末0.17 g（约含PNS 20 mg）置于100 mL容量瓶中，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。取供试品溶液20 μL进行分析，按上述的色谱条件测定，计算三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的含量，结果3批肠溶微丸中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量分别为12.62、65.39、40.06 mg·g-1，在PNS中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量分别为10.40%、53.01%、32.49%。（见表2）

表2 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量

2.5 PNS肠溶微丸体外释放度 释放度测定法根据2020年版《中华人民共和国药典》通则0931溶出度与释放度测定法检测。

2.5.1 酸中释放度 取0.1 mol/L盐酸溶液900 mL，注入每个溶出杯中，待溶液温度恒定在(37.0±0.5)℃，取供试品6粒分别投入溶出杯中，启动仪器，2 h后在规定取样点吸取溶出液适量，滤过，自取样至滤过应在30 s内完成。按上述色谱条件测定。

2.5.2 缓冲液中释放度 弃去上述各溶出杯中盐酸溶液，立即加入温度为（37±0.5）℃的磷酸盐缓冲液（pH值=6.8）900 mL，启动仪器，分别于5、15、30、45、60、90 min规定取样点吸取溶出液适量，滤过，自取样至滤过应在30 s内完成。按上述色谱条件测定。（见表3、图2）

表3 3批制剂在酸中、磷酸盐缓冲液中的释放度（±s，%，n=6）

表3 3批制剂在酸中、磷酸盐缓冲液中的释放度（±s，%，n=6）

批号 组份 酸中2 h pH值=6.8的磷酸盐缓冲液中时间（min）515 30 45 60 90110601 三七皂苷R1 2.18±1.23 14.11±2.04 25.02±2.6987.18±1.84 98.06±5.34102.91±4.14101.80±6.17人参皂苷Rb1 1.87±0.57 15.38±2.36 36.64±1.3280.27±3.79 98.79±5.06103.86±5.27101.71±4.04人参皂苷Rg1 2.30±0.88 13.01±1.4528.77±3.2780.27±3.79 98.79±5.06103.86±5.27101.71±4.04110603 三七皂苷R1 2.04±0.92 14.44±1.72 30.44±2.5687.76±3.55 98.42±3.92 99.71±4.12 98.65±5.97人参皂苷Rb1 2.09±1.73 15.07±2.32 36.37±3.0689.67±4.39100.63±4.89101.16±5.88101.07±5.48人参皂苷Rg1 2.72±0.92 11.64±2.6229.08±3.9781.25±4.42100.97±3.83102.25±3.48 98.57±5.04110605 三七皂苷R1 2.05±0.74 14.55±1.73 30.47±3.3880.09±4.38 94.92±5.13100.06±5.56 97.32±5.17人参皂苷Rb1 1.97±1.09 16.71±2.97 33.92±3.5386.70±3.49 99.06±4.89101.56±5.72100.36±5.54人参皂苷Rg1 2.19±1.54 15.69±1.5228.99±3.7180.66±4.67100.83±3.09103.87±3.88 99.89±6.29

图2 3批制剂在缓冲液中的释放度（pH值=6.8）

结果表明，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1在酸中释放量小于标示量的10%，在pH值=6.8的缓冲液中45 min累积释放量大于标示量的70%，符合制剂要求。

3 讨论

据前期研究发现[7-9]，三七总皂苷口服给药在酸性条件下会降解为苷元，而小肠是其最佳吸收部位，为提高三七总皂苷的口服生物利用度，笔者将其制备成肠溶微丸[19-20]。试验中考察了加热回流和超声提取两种方法，两种方法提取效率相当，考虑超声提取更快捷方便，故采用超声法提取该制剂中的皂苷类成分。参考相关文献[18-20]及2020年版《中华人民共和国药典》，采用HPLC法用乙腈-水梯度洗脱，能同时检测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb13个指标成分,且分离度良好，辅料无干扰，检测时间短，可以准确、快速地实现PNS肠溶微丸的定量测定。在体外释放度考察中，三七总皂苷肠溶微丸中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1即使在酸液中有溶出释放，也易被破坏降解而难以检测出来，因此选择磷酸盐缓冲液（pH值=6.8）作为释放介质测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的体外释放量。笔者以三七总皂苷的胃肠道吸收特性研究为基础，进行了肠溶制剂的研究，并建立PNS肠溶微丸的指标成分三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的HPLC含量测定方法，并对3批PNS肠溶微丸进行体外释放度考察。根据前期研究[7-9]，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1在PNS原料中的含量分别为9.16%、57.90%与32.57%，制成PNS肠溶微丸后在PNS中的含量为分别为10.40%、53.01%与32.49%，差异不明显，说明PNS主要有效成分的含量在制备过程中无明显变化。释放度测定结果表明，3批制剂的体外释放度良好，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1的释放行为无明显差异，符合《中华人民共和国药典》对肠溶制剂的要求，上述研究结果减少了制剂开发的盲目性，为今后三七总皂苷口服给药途径的研究提供了重要实验依据。